草酸鈣（CaOx）腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一。腎組織中CaOx晶體過(guò)飽和沉積會(huì)導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷和凋亡，從而導(dǎo)致腎結(jié)石的形成。短鏈脂肪酸由腸道內(nèi)厭氧細(xì)菌發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生，不僅在局部腸道屏障中發(fā)揮作用，而且在系統(tǒng)水平上也發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，丁酸是最豐富的短鏈脂肪酸，具有抗炎和免疫抑制作用,本研究探討丁酸對(duì)CaOx腎結(jié)石的作用及其潛在靶點(diǎn)。

圍繞草酸鈣腎結(jié)石相關(guān)機(jī)制研究，華山醫(yī)院泌尿外科吳忠教授、周子健博士于今年5月在Chem Biol Interact發(fā)表了相關(guān)成果，7月4日該團(tuán)隊(duì)又有一篇新作發(fā)表。吳忠教授、周子健博士在Food and Chemical Toxicology（IF=4.3）上發(fā)表題為“Butyric acid inhibits oxidative stress and inflammation injury in calcium oxalate nephrolithiasis by targeting CYP2C9”的研究文章。研究人員發(fā)現(xiàn)丁酸在體外和體內(nèi)均能抑制CaOx腎結(jié)石模型的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CYP2C9是丁酸影響CaOx腎結(jié)石的靶基因，最后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CYP2C9在草酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷模型中的作用。拜譜生物與吳忠教授、周子健博士團(tuán)隊(duì)再次合作，提供了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)服務(wù)，助力預(yù)測(cè)CYP2C9是丁酸影響CaOx腎結(jié)石的潛在靶點(diǎn)，為丁酸預(yù)防CaOx腎結(jié)石產(chǎn)生的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

文章名稱(chēng)：Butyric acid inhibits oxidative stress and inflammation injury in calcium oxalate nephrolithiasis by targeting CYP2C9（Food Chem Toxicol.，IF=4.3，2023.07）

客戶(hù)單位：華山醫(yī)院

研究對(duì)象：大鼠、HK-2細(xì)胞

分組信息：對(duì)照組（Con）、模型組（Model）和丁酸鈉組（NaB）

拜譜提供技術(shù)：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢測(cè)

思路流程圖

研究結(jié)果

研究人員首先構(gòu)建大鼠模型，通過(guò)生理生化指標(biāo)和組織病理學(xué)染色等研究手段發(fā)現(xiàn)丁酸可以減少CaOx模型大鼠腎CaOx晶體的形成和損傷，改善CaOx模型大鼠的炎癥損傷和氧化物質(zhì)的過(guò)度表達(dá)。此外，丁酸還可抑制草酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

為探究丁酸結(jié)構(gòu)和靶基因網(wǎng)絡(luò)，研究人員從PubChem獲取丁酸和丁酸酯的二維和三維結(jié)構(gòu)（圖1A）。通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)處理后共篩選出118個(gè)丁酸靶基因供進(jìn)一步分析。將基因列表導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。Cytoscape給出了排序的前20的樞紐靶基因的詳細(xì)網(wǎng)絡(luò)圖，包括CYP2C9、CASP3、MAPK14、ALB、HRAS、ABL、RARA、RARG、RXRB、PRKACA、NOS3、SRC、MMP9、KDR、HSP90AA1、HPGDS、GSTA3、GSTA1、GSR和GSTM2（圖1B）。這些樞紐基因與網(wǎng)絡(luò)中的其他基因均表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，說(shuō)明這些基因可能發(fā)揮著協(xié)同作用。GO和KEGG分析揭示了丁酸樞紐基因的相關(guān)途徑和生物學(xué)功能（圖1C）。樞紐基因主要與類(lèi)固醇激素應(yīng)答、氧化應(yīng)激應(yīng)答、活性氧細(xì)胞對(duì)類(lèi)固醇激素刺激的反應(yīng)以及對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)有關(guān)。綜上所述，這些樞紐基因主要參與了氧化應(yīng)激和對(duì)活性氧的生物反應(yīng)過(guò)程，是腎結(jié)石形成機(jī)制中至關(guān)重要的途徑，這表明丁酸可能在腎結(jié)石中發(fā)揮重要作用。

圖1| 丁酸結(jié)構(gòu)與靶基因網(wǎng)絡(luò)分析(圖源：Zijian Zhou., et al., Food Chem Toxicol.

為進(jìn)一步探索丁酸對(duì)CaOx腎結(jié)石的確切靶基因，研究人員利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GSE73680中健康對(duì)照與CaOx腎結(jié)石患者的基因差異進(jìn)行了研究。對(duì)照組與CaOx結(jié)石患者的顯著性差異表達(dá)基因（DEGs）篩查標(biāo)準(zhǔn)為P < 0.05、|log2(FC)| > 1。共篩選到3783個(gè)基因發(fā)生顯著變化，其中3379個(gè)（89.4%）基因表達(dá)上調(diào)，404個(gè)（10.6%）基因表達(dá)下調(diào)（圖2A）。對(duì)DEGs進(jìn)行聚類(lèi)分析，熱圖顯示了前10個(gè)被選中DEGs的二維分層聚類(lèi)特征（圖2B）。隨后，研究人員通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)人工鑒定了370個(gè)可能與CaOx腎結(jié)石相關(guān)的基因，排名前20位的預(yù)測(cè)基因及其相關(guān)性評(píng)分如圖2C所示。為了找到丁酸治療CaOx腎結(jié)石的關(guān)鍵靶點(diǎn)，研究人員將PharmMapper中的丁酸靶點(diǎn)、GEO中的DEGs和GeneCards中的CaOx腎結(jié)石相關(guān)基因處理得到了一個(gè)Venn圖。最終，CYP2C9被確定為丁酸影響CaOx腎結(jié)石的潛在靶點(diǎn)(圖2D)。此外，研究人員還進(jìn)行了丁酸與CYP2C9的分子對(duì)接，CYP2C9的三個(gè)氨基酸殘基ASN-474、LYS-48和GLY-46與丁酸相互作用，氫鍵能為4.2 kcal/mol（圖2E）。

在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)CYP2C9是丁酸影響CaOx腎結(jié)石的靶基因后，研究人員還通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CYP2C9可降低草酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的ROS水平、炎癥損傷和凋亡。

圖2| 多數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分析預(yù)測(cè)CYP2C9是丁酸作用于CaOx腎結(jié)石的靶基因

研究結(jié)果

本研究首先發(fā)現(xiàn)丁酸在體外和體內(nèi)均能抑制CaOx腎結(jié)石模型的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，隨后通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到丁酸影響CaOx腎結(jié)石的潛在靶點(diǎn)——CYP2C9，最后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CYP2C9在草酸鹽誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS水平、炎癥損傷和凋亡。這些發(fā)現(xiàn)表明丁酸可能通過(guò)抑制CYP2C9來(lái)抑制CaOx腎結(jié)石的氧化應(yīng)激，減輕炎癥損傷。這一過(guò)程中拜譜生物提供了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)服務(wù)，此外拜譜生物可提高成熟完善的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)產(chǎn)品及技術(shù)服務(wù)，歡迎致電咨詢(xún)！

參考文獻(xiàn)：Zhou Z, Zhou X, Zhang Y, Yang Y, Wang L, Wu Z. Butyric acid inhibits oxidative stress and inflammation injury in calcium oxalate nephrolithiasis by targeting CYP2C9. Food Chem Toxicol. 2023 Aug. doi: 10.1016/j.fct.2023.113925.