糖分子自身的復(fù)雜性和許多N-glycoproteins低表達(dá)水平使得對N-glycosylation結(jié)構(gòu)的表征的描述極為困難。在檢測低豐度的N糖基化修飾蛋白或肽段時,其中摻雜大量未修飾的蛋白肽斷,這很容易將低豐度的糖基化修飾蛋白肽段的信號掩蓋。凝素親和法是目前糖蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分離富集方法。凝集素(lectin)是一類糖結(jié)合蛋白質(zhì),能專一識別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合,它們與糖鏈可逆非共價結(jié)合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后,通常用特定的單糖通過競爭結(jié)合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。
蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后利用凝集素(lectin)富集N-糖基化肽段,然后用N-糖酰胺酶(PNGase)在H218O中切除連接在天冬酰胺殘基(Asn)上的糖鏈。該處理致使Asn分子量增加2.9890Da。最后用高精度LC-MS質(zhì)譜儀檢測脫糖后的肽段,通過檢索數(shù)據(jù)庫,確認(rèn)脫糖后分子量與其理論分子量的變化以及糖基化修飾肽段的序列,從而確定該蛋白質(zhì)的N-糖基化位點。N-糖基化位點確定之后,再利用label-free的原理對其進(jìn)行定量分析。
樣本類型 | 常規(guī)送樣量 |
植物葉片 | 濕重≥3g |
植物根莖、木質(zhì)部、韌皮部等 | 濕重≥5g |
細(xì)胞樣品 | 細(xì)胞量濕重≥5*10^7 |
組織樣品 | 人、動物、微生物濕重≥50mg |
體液樣品 | 血清、血漿體積≥200μl,腦脊液≥500μl,尿液≥1000μl |