T細(xì)胞可以識別惡性細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHCs）上的肽表位，引起抗腫瘤免疫反應(yīng)。理論上，抗腫瘤表位可能來自兩類抗原：

第一類抗原稱為腫瘤相關(guān)抗原（TAAs），它們在惡性腫瘤中異常表達(dá)或僅在分化的特定階段產(chǎn)生，而在正常組織中的表達(dá)極為有限。TAAs是非突變的自身抗原，其臨床應(yīng)用受限于中央T細(xì)胞的耐受性。

第二類則是腫瘤細(xì)胞基因組突變（如SNVs、INDEL、基因融合、SVs）所產(chǎn)生的獨(dú)特肽段，也被稱為新生抗原或腫瘤特異性抗原（TSAs）。此外，新抗原也可能來源于異常轉(zhuǎn)錄組變異（如轉(zhuǎn)錄本選擇性剪接、順式作用元件突變、剪接因子反式作用的改變、無義介導(dǎo)的RNA衰減、多聚腺苷酸化和RNA編輯、非編碼區(qū)）、蛋白質(zhì)組變異（如翻譯后修飾（PTMs）異常、蛋白酶體加工受損或TAP復(fù)合物）和病毒ORF等（圖1）。與TAAs相比，新抗原在其獨(dú)特的腫瘤特異性方面具有明顯的優(yōu)勢(表1)，將為有效的腫瘤個(gè)性化治療提供理想的靶點(diǎn)。

表1 TAAs和TSAs的特點(diǎn)

（表源. Xie et al.Signal Transduction Targeted Ther.2023）

圖1 腫瘤新生抗原的產(chǎn)生

(圖源：Xie et al.Signal Transduction Targeted Ther. 2023)

01、免疫原性新抗原的鑒定

免疫基因組學(xué)策略是利用NGS來比較腫瘤和正常組織之間的遺傳變化。目前，從NGS數(shù)據(jù)中檢測可能新抗原是利用腫瘤和正常的RNA/DNA測序數(shù)據(jù)來定位腫瘤特異性基因異常。同時(shí)，RNA-seq數(shù)據(jù)與WES結(jié)合可以確定腫瘤組織中表達(dá)的突變基因，RNA-seq還可以發(fā)現(xiàn)更多隱藏的生物信息，如拷貝數(shù)變化、微生物污染、轉(zhuǎn)座因子、細(xì)胞類型等信息。RNA-seq也可用于檢測選擇性剪接事件，并估計(jì)突變等位基因表達(dá)的相對頻率。最近的研究表明，當(dāng)假定無義衰變（NMD）存在時(shí)，抗原多肽是由具有移碼突變和非典型剪接模式的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的，為了完全識別由移碼突變和異常亞型導(dǎo)致的新抗原，需要來自全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的精確肽序列。

基于質(zhì)譜技術(shù)的免疫肽組學(xué)可以直接檢測免疫沉淀提取的MHC結(jié)合多肽，實(shí)現(xiàn)高通量鑒定MHC上呈遞的多肽（圖2）。除了由異常的DNA序列或RNA表達(dá)引起的新抗原外，基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)還為蛋白質(zhì)水平上的新抗原檢測提供了“金標(biāo)準(zhǔn)”，這是從DNA和RNA研究中無法發(fā)現(xiàn)的。例如，MS可用于檢測由細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中PTMs失調(diào)引起的新型MHC相關(guān)新抗原。此外，MS與NGS集成，可進(jìn)一步檢測體細(xì)胞突變、非編碼RNA和蛋白酶體剪接產(chǎn)生的腫瘤特異性新抗原。整合基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，將有利于基于免疫肽組的新抗原鑒定。

圖2 基于質(zhì)譜的新抗原鑒定技術(shù)路線

(圖源. Bassani-Sternberg, Michal et al.MCP. 2015 )

02、計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測新抗原

新抗原預(yù)測的典型工作流程可以總結(jié)為以下步驟：（i）突變識別，（ii）HLA分型，（iii）基于HLA結(jié)合親和力的新抗原過濾和優(yōu)先排序，以及（iv）使用基于T細(xì)胞的檢測對免疫原性新抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖3）。

圖3 新抗原預(yù)測的計(jì)算工作流程

（圖源：Xie et al.Signal Transduction Targeted Ther. 2023）

基于MHC分子的加工和呈遞過程，已經(jīng)創(chuàng)建了許多用于計(jì)算機(jī)預(yù)測的工具來發(fā)現(xiàn)新抗原，包括NetChop、NetCTL和NetCTLpan等（圖3）。通過將HLA-配體數(shù)據(jù)納入機(jī)器學(xué)習(xí)算法，已經(jīng)顯著提高了預(yù)測能力。NetMHCpan和MHCflurry利用體外Peptides-HLA Binding數(shù)據(jù)集來訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)模型，是當(dāng)前HLA配體識別管道的主要組成部分，與最先進(jìn)的方法相比，NetMHCpan通過整合結(jié)合親和力數(shù)據(jù)和MS多肽組數(shù)據(jù)，為MHC-I等位基因提供一種“全特異性”機(jī)器學(xué)習(xí)策略，提高了腫瘤新抗原的預(yù)測性能。最近的兩項(xiàng)研究創(chuàng)建了名為MSIntrinice和EDGE的計(jì)算框架，利用從RNA-seq和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）數(shù)據(jù)中獲得的HLA肽，可以高效地預(yù)測HLA抗原。

新的證據(jù)已經(jīng)證明了MHC-II新抗原在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要意義。利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)開發(fā)了大量預(yù)測MHC-II結(jié)合表位的計(jì)算技術(shù)，包括NetMHCII、NetMHCIIpan、RNAKPEP、MULTIPRED2、ProPred和MHCPred。然而，與MHC-I分子相比，MHC-II-peptides結(jié)合親和力的計(jì)算預(yù)測目前還不那么精確。近年來，基于轉(zhuǎn)錄組和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的計(jì)算方法已經(jīng)發(fā)展起來。在淋巴瘤數(shù)據(jù)訓(xùn)練集中，由MARIA訓(xùn)練的深度學(xué)習(xí)模型優(yōu)于最廣泛使用的NetMHCIIpan3.1。然而，還需要更多的研究使用重要的數(shù)據(jù)集來證明其穩(wěn)健性和有效性。

大多數(shù)通過MHC分子呈遞預(yù)測的新抗原不會(huì)觸發(fā)免疫反應(yīng)。因此，在評估潛在新抗原的免疫原性時(shí)，尤其需要考慮pMHC復(fù)合物的TCR識別。計(jì)算機(jī)模型可以預(yù)測新抗原特異性T細(xì)胞的識別，如NetCTL/NetCTLpan和基于機(jī)器學(xué)習(xí)的TCR-peptides/-pMHC binding。然而，由于TCR對其pMHC配體的低親和力，預(yù)測TCR和pMHC的結(jié)合親和力仍然具有挑戰(zhàn)性。

03、候選新抗原免疫原性的評價(jià)與驗(yàn)證

新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞通常利用T細(xì)胞檢測、多色標(biāo)記的MHC四聚體、酶聯(lián)免疫吸附點(diǎn)（ELISpot）和T細(xì)胞文庫分析進(jìn)行驗(yàn)證或篩選。T細(xì)胞免疫原性檢測是評價(jià)候選新抗原免疫原性最直接的方法。通過癌癥外顯子組/RNA-seq發(fā)現(xiàn)的一整套可能的突變多肽，都可以使用來自癌癥患者或健康捐贈(zèng)者的T細(xì)胞進(jìn)行檢測。這些技術(shù)依賴于表位預(yù)測，通量較低，因?yàn)樗鼈冎荒苡行У厣蒑HC I類等位基因的一個(gè)子集。將單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）與應(yīng)答細(xì)胞群的TCR測序相結(jié)合，可用于提高檢測的靈敏度。

一些無偏的TCR-guided新抗原發(fā)現(xiàn)策略已經(jīng)被開發(fā)出來系統(tǒng)地描述新抗原特異性TCR。酵母展示的pMHC文庫可用于發(fā)現(xiàn)新抗原特異性TCR，然而，制備可溶性TCR試劑是一個(gè)耗時(shí)的過程，如果沒有新抗原的內(nèi)源性處理或T細(xì)胞的功能激活，所識別的隨機(jī)肽可能不能代表生理上的TCR-pMHC相互作用。為了克服這些缺點(diǎn)，可以利用不同的生物過程在共培養(yǎng)系統(tǒng)中標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞。一種方法利用被稱為信號傳導(dǎo)和抗原呈遞雙功能受體（SABRs）的嵌合受體，它可以在pMHC-TCR相互作用后誘導(dǎo)TCR樣信號。SABRs能夠成功識別TCR-pMHC相互作用，可用于已知的公共TCR和個(gè)體新抗原特異性TCR。T-Scan是一種獨(dú)立于預(yù)測算法的TCR表位掃描方法，它依賴于T細(xì)胞殺傷的生理活性，比以前的方法產(chǎn)生更大的抗原空間。因此，這些發(fā)現(xiàn)TCR配體的新興方法將有助于研究候選新抗原的免疫原性，為免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

04、總結(jié)

下一代測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，加速了腫瘤特異性新抗原的快速識別和預(yù)測。通過了解新抗原誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)的機(jī)制，以及通過簡化基于新抗原的免疫治療的過程，將有助于癌癥治療的快速發(fā)展。

拜譜小結(jié)

腫瘤新生抗原（neoantigen）是由體細(xì)胞突變產(chǎn)生的能誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞識別的多肽，是一種腫瘤特異性抗原，是腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。目前基于新生抗原的研發(fā)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤疫苗、過繼性免疫細(xì)胞治療、抗體藥等多個(gè)方面。新抗原的鑒定是開發(fā)有效免疫療法的關(guān)鍵步驟。鑒定新抗原表位有兩種主要策略：①免疫基因組學(xué)方法：基于高通量測序的計(jì)算機(jī)方法創(chuàng)建虛擬肽組；②免疫肽組學(xué)方法：使用質(zhì)譜分析MHC結(jié)合肽段。拜譜生物作為國內(nèi)領(lǐng)先的多組學(xué)公司，可提供完善成熟的蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)體系。近期，拜譜生物將推出基于質(zhì)譜分析的免疫肽組檢測服務(wù)，敬請期待！

參考文獻(xiàn)

1.Xie N,Shen G,Gao W, et al. Neoantigens: promising targets for cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 2023;8 (1):9. doi:10.1038/s41392-022-01270-x

2.Bassani-Sternberg M,Pletscher-Frankild S,Jensen LJ, et al. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol Cell Proteomics. 2015;14 (3):658-73. doi:10.1074/mcp.M114.04281