背景

福爾馬林固定和石蠟包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE）是臨床組織保存的主要形式。據(jù)估計(jì)，全球有超過(guò)10億個(gè)組織樣本被保存在醫(yī)院和生物樣本庫(kù)中，而其中大多數(shù)都是以FFPE形式儲(chǔ)存的。對(duì)于某些類型的腫瘤組織，F(xiàn)FPE樣品通常是唯一來(lái)源，這些樣本可以為研究人員提供有關(guān)某些最罕見(jiàn)的癌癥和其他疾病的重要信息。近年來(lái)，隨著脫蠟技術(shù)的成熟和質(zhì)譜儀器的發(fā)展，F(xiàn)FPE樣本的科研價(jià)值得到充分開(kāi)發(fā)，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的高分文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量急速上漲。

因此，針對(duì)石蠟切片樣本的特性，拜譜生物對(duì)切片脫蠟、蛋白提取、肽段酶解、上機(jī)測(cè)試等全流程進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合全新一代Astral質(zhì)譜平臺(tái)高穩(wěn)定性、高靈敏度、高通量、高深度的優(yōu)勢(shì)，在大隊(duì)列樣本中穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)8000+蛋白數(shù)量的檢出，開(kāi)啟“超高深度FFPE蛋白質(zhì)組”鑒定新紀(jì)元！

產(chǎn)品介紹

超高深度FFPE蛋白質(zhì)組研究的主要步驟包括：FFPE切片脫蠟復(fù)水、蛋白質(zhì)提取、肽段酶解、LC-MS/MS分析、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、數(shù)據(jù)分析和生信分析等。

圖1 超高深度FFPE蛋白質(zhì)組的技術(shù)路線

實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)

拜譜生物采用主流脫蠟策略（二甲苯法），通過(guò)添加去垢劑和還原劑后沸水孵育超聲，在高溫條件下打斷亞甲橋，來(lái)降低FFPE樣本中甲醛交聯(lián)帶來(lái)的影響，從而增強(qiáng)FFPE樣本蛋白質(zhì)提取。并結(jié)合全新一代Astral革命性質(zhì)譜平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)譜采集，對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，得到的項(xiàng)目實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)表明，大隊(duì)列樣本均穩(wěn)定在8000以上的蛋白鑒定數(shù)量（圖2）。另外，拜譜生物還提供特色生信分析和個(gè)性化定制分析，以全流程優(yōu)質(zhì)服務(wù)助力客戶的項(xiàng)目研究。

圖2 超高深度FFPE蛋白質(zhì)組項(xiàng)目實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)

應(yīng)用案例

1.回顧性研究

應(yīng)用案例：甲狀腺乳頭癌

文獻(xiàn)名稱：Risk stratification of papillary thyroid cancers using multidimensional machine learning

發(fā)表期刊：International Journal of Surgery，IF=15.3，2023年11月

技術(shù)方法：DIA蛋白組

樣本類型：甲狀腺乳頭癌FFPE樣本和FNA活檢樣本

研究?jī)?nèi)容：

甲狀腺乳頭癌（PTC）是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，具有不同的風(fēng)險(xiǎn)水平。然而，PTC的術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估仍然是全世界的一個(gè)挑戰(zhàn)。研究者在2013-2020年收集了558名患者的腫瘤組織FFPE樣本和活檢FNA樣本，樣本分三組進(jìn)行DIA蛋白組分析，共鑒定出5,774個(gè)與PTC相關(guān)的蛋白質(zhì)，在這些蛋白中，有3種蛋白在模型中表現(xiàn)出顯著的權(quán)重，成為評(píng)估PTC風(fēng)險(xiǎn)程度的關(guān)鍵定量指標(biāo)，根據(jù)回顧性隊(duì)列中274例FFPE樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床信息等多維特征，建立了一個(gè)包含17個(gè)變量的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，有助于PTC術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，減少不必要的手術(shù)降低過(guò)度治療。

圖3 結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)PTC回顧性研究隊(duì)列進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層

2.疾病診斷分型

應(yīng)用案例：乳腺癌

文獻(xiàn)名稱：Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes

發(fā)表期刊：Nature Communications，IF=16.6，2022年3月

技術(shù)方法：蛋白組學(xué)

樣本類型：300例乳腺癌確診患者的FFPE組織標(biāo)本

研究?jī)?nèi)容：

乳腺癌是全球女性高發(fā)的一種惡性腫瘤，盡管乳腺癌的基因組分類取得了進(jìn)展，但目前的臨床測(cè)試和治療決策通?；诘鞍踪|(zhì)水平信息。因此，研究者對(duì)兩個(gè)時(shí)間段乳腺癌診斷患者隊(duì)列共300個(gè)FFPE手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在侵襲性PAM50分型的基底樣(basal-like)病例中，存在兩種生存期差異明顯的亞型（2號(hào)亞型和3號(hào)亞型），Kaplan-Meier生存曲線和Forest多變量生存分析結(jié)果顯示，這兩種蛋白亞型在無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）和總生存期（OS）上都有著明顯的差異，其中3號(hào)亞型是四種蛋白亞型中預(yù)后結(jié)果最好的而2號(hào)亞型則是最差。研究者對(duì)88例三陰性乳腺癌病例的分析也證實(shí)了這種差異的存在，為臨床上乳腺癌的精準(zhǔn)分型與治療提供依據(jù)。

圖4 蛋白組學(xué)分析將乳腺癌分成3種疾病亞型（Karama A, et al., Nat Commun, 2022）

3.治療靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用案例：胃腸道間質(zhì)瘤

文獻(xiàn)名稱：Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors

發(fā)表期刊：Gastroenterology，IF=29.4，2023年11月

技術(shù)方法：蛋白組學(xué)、磷酸化蛋白組學(xué)

樣本類型：193例未經(jīng)治療的胃腸道間質(zhì)瘤FFPE樣本

研究?jī)?nèi)容：

胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是最常見(jiàn)的胃腸道間充質(zhì)腫瘤，具有較高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率。研究人員對(duì)193例GIST患者進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，不同位置或不同組織學(xué)級(jí)別的GIST其分子特征具有差異，在腫瘤中高表達(dá)的蛋白在剪接體和間隙連接中顯著富集，在磷酸化蛋白質(zhì)組中也有相同發(fā)現(xiàn)，而在癌旁中上調(diào)的蛋白在代謝相關(guān)通路中富集。對(duì)于癌旁的磷酸化蛋白質(zhì)組，富集途徑與觀察到的蛋白質(zhì)不同，是通過(guò)PKC和MAPK調(diào)節(jié)Rho蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活GTPase活性和胃泌素-CREB信號(hào)途徑。MAPK7被鑒定并在功能上被證明與GIST中的腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，SQSTM1表達(dá)增加會(huì)抑制患者對(duì)甲磺酸伊馬替尼的反應(yīng)。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SRSF3在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和導(dǎo)致預(yù)后不良中的作用。該研究識(shí)別不同位置胃腸道間質(zhì)瘤的生物標(biāo)志物，依據(jù)GIST腫瘤發(fā)病位置異質(zhì)性來(lái)篩選精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)。

圖5 不同位置胃腸道間質(zhì)瘤生物標(biāo)志物特征（Sun MJ, et al., Gastroenterology, 2023）

4.多組學(xué)聯(lián)合分析

應(yīng)用案例：高級(jí)別成人彌漫性膠質(zhì)瘤

文獻(xiàn)名稱：Proteomics separates adult-type diffuse high-grade gliomas in metabolic subgroups independent of 1p/19q codeletion and across IDH mutational status

發(fā)表期刊：Cell Reports Medicine，IF=14.3，2023年1月

技術(shù)方法：蛋白組學(xué)、磷酸化蛋白組學(xué)、全基因組甲基化和拷貝數(shù)變異（CNV）分析

樣本類型：IDH野生型(IDHwt)膠質(zhì)瘤、IDH突變型(IDHmut)膠質(zhì)瘤以及非腫瘤對(duì)照組的共42個(gè)FFPE樣本

研究?jī)?nèi)容：

高級(jí)別成人彌漫性膠質(zhì)瘤是一種惡性神經(jīng)上皮腫瘤，約占惡性原發(fā)性腦腫瘤的80%，WTO目前的分類是基于IDH1/2突變和1p/19q共缺失狀態(tài)。膠質(zhì)瘤蛋白質(zhì)組研究有利于實(shí)現(xiàn)更好的患者分子分層和治療靶點(diǎn)識(shí)別。研究者通過(guò)全基因組甲基化分析和拷貝數(shù)變異（CNV）分析對(duì)所有腫瘤（表觀）遺傳學(xué)進(jìn)行了表征。應(yīng)用FFPE蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白組學(xué)，共檢測(cè)到5,724個(gè)蛋白質(zhì)和5,212個(gè)高置信度磷酸位點(diǎn)。多組學(xué)分析表明IDHmut膠質(zhì)瘤可以分為兩種亞型，它們具有不同的能量代謝，總體上比1p/19q編碼引起的差異更大。使用三個(gè)獨(dú)立的膠質(zhì)瘤蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證后，確認(rèn)了這些亞組，并將IDHmut亞型與IDHwt膠質(zhì)瘤中已建立的原神經(jīng)和經(jīng)典/間充質(zhì)亞型聯(lián)系起來(lái)，對(duì)IDHmut膠質(zhì)瘤患者的治療具有潛在的意義。

圖6 FFPE多組學(xué)研究概述（Jakob MB, et al., Cell Rep Med, 2023）

送樣建議

拜譜小結(jié)

石蠟切片作為醫(yī)學(xué)中的常見(jiàn)樣本，具有重要研究?jī)r(jià)值。針對(duì)石蠟切片樣本的特性，拜譜生物推出全新超高深度FFPE蛋白質(zhì)組產(chǎn)品，多次不同樣本測(cè)試均可實(shí)現(xiàn)單針8000+的蛋白檢出。高深度的蛋白檢出可以充分利用罕見(jiàn)疾病或腫瘤等FFPE樣本，實(shí)現(xiàn)大隊(duì)列樣本回顧性研究、疾病診斷分型、治療靶點(diǎn)篩選、多組學(xué)聯(lián)合分析等豐富的研究應(yīng)用！

參考文獻(xiàn)

[1] Li YH, Wu F, Ge WG, et al. Risk stratification of papillary thyroid cancers using multidimensional machine learning. Int J Surg. 2023 Nov. 37916932. doi: 10.1097/JS9.0000000000000814.

[2] Karama A, Gian LN, Sandra ES, et al. Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes. Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):896. doi: 10.1038/s41467-022-28524-0.

[3] Sun MJ, Tong YX, Yuan W, et al. Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 2023 Nov 21:S0016-5085(23)05509-9.

[4] Jakob MB, Nikolaus D, Martin M, et al. Proteomics separates adult-type diffuse high-grade gliomas in metabolic subgroups independent of 1p/19q codeletion and across IDH mutational status. Cell Rep Med. 2023 Jan 17;4(1):100877. doi: 10.1016/j.xcrm.2022.100877.