細胞膜偽裝納米粒子具有源自其膜結(jié)構(gòu)和表面抗原的固有優(yōu)勢，包括在血流中的長時間循環(huán)、特定的細胞識別和靶向能力以及免疫治療的潛力。

2024年6月，四川大學(xué)華西醫(yī)院錢志勇教授團隊在Signal Transduction and Targeted Therapy上發(fā)表了題為“Genetically programmable cell membrane-camouflaged nanoparticles for targeted combination therapy of colorectal cancer”的研究論文。本研究介紹了一種稱為 MPB-3BP@CM NPs 的細胞膜仿生納米藥物平臺。該平臺利用微孔普魯士藍納米顆粒 (MPB NPs) 作為光熱敏化劑和3-溴丙酸 (3BP) 的載體，并將其包裹在表達高親和力信號調(diào)節(jié)蛋白 α (SIRPα) 變體的細胞膜中，具有延長血液循環(huán)時間、有效靶向大腸癌細胞CD47的能力，并通過阻斷 CD47-SIRPα 相互作用增強巨噬細胞對大腸癌細胞的吞噬作用。在體內(nèi)外實驗中顯示出顯著的抗腫瘤活性和極低的全身毒性，為提高結(jié)直腸癌治療的療效和安全性提供了新的視角。拜譜生物為該研究成果提供了能量代謝絕對定量技術(shù)，這項研究的結(jié)果為工程化疾病定制細胞膜用于腫瘤治療引入了一種通用方法。

文章名稱：Genetically programmable cell membrane-camouflaged nanoparticles for targeted combination therapy of colorectal cancer（Signal Transduction and Targeted Therapy，IF=39.3，2024.6）

客戶單位：四川大學(xué)華西醫(yī)院

研究材料：小鼠皮下組織&貼壁培養(yǎng)細胞

拜譜提供技術(shù)：靶向能量代謝

一、研究結(jié)果

01.MPB-3BP@CM NPs的制備和表征

制備MPB-3BP@CM NP的第一步是合成MPB NP。MPB NPs納米結(jié)構(gòu)的多孔特性，這對高效載藥至關(guān)重要。3BP被稱為“代謝災(zāi)難”，對糖酵解具有抑制作用，在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡以及在臨床前研究中預(yù)防腫瘤生長方面表現(xiàn)出顯著的功效。隨后，將3BP加載到MPB NPs腔中，得到MPB-3BP NPs。為了制備CM-MSIRPα，將DsRed蛋白與MSIRPα受體（DsRed-MSIRPα）融合以提供紅色熒光。隨后，建立了穩(wěn)定的人胚胎腎293 T（HEK 293 T）細胞系，在其細胞膜上表達MSIRPα受體（HEK 293T-MSIRPα）。為了提取純化的CM-MSIRPα，培養(yǎng)HEK 293T-MSIRPα細胞，并進行純化過程。為了將CM-MSIRPα涂覆在MPB-3BP NPs的表面，將兩種組分共擠出400和200 nm聚碳酸酯多孔膜，得到MPB-3BP@CM NPs（圖1）。

圖1|MPB-3BP@CM NPs的表征

02.細胞結(jié)合和攝取、體外毒性及抗腫瘤效果

癌細胞采用各種策略來逃避免疫監(jiān)視和吞噬作用，其中之一涉及CD47配體的上調(diào)。這些配體與SIRPα受體相互作用，傳遞“不要吃我”的信號，抑制巨噬細胞吞噬癌細胞。為了研究MPB-3BP@CM NPs是否可以通過MSIRPα-CD47相互作用與結(jié)直腸癌（CRC）細胞結(jié)合，使用蛋白質(zhì)印跡分析選擇表達CD47的人CRC癌細胞系HCT116，然后在體外孵育MPB-3BP@CM NPs。結(jié)果顯示，在孵育期2小時后，MPB-3BP@CM NPs與HCT116細胞的細胞膜表面有牢固的結(jié)合。此外,免疫共沉淀法（CO-IP）進一步證實MSIRPα與CD47之間的分子相互作用?？偟膩碚f，這些結(jié)果說明了MPB-3BP@CM NPs（在其表面呈遞MSIRPα受體）與HCT116細胞之間通過MSIRPα和CD47之間的結(jié)合而有效的相互作用，且HCT116細胞在攝取MPB-3BP@CM NPs方面表現(xiàn)出顯著的效率（圖2a-f）。

在體內(nèi)治療前，先對MPB-3BP@CM NPs進行體外細胞毒性評價。溶血試驗和甲基噻唑四氮唑(MTT)試驗均證實其良好的血液和生物相容性。進一步使用MTT法評估MPB-3BP@CM NPs的抗腫瘤效率，結(jié)果表明，MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射具有較強的抗癌活性，與同等劑量的光熱劑治療和其他激光組相比，其治療效果顯著提高。總的來說，優(yōu)越的抗癌功效可歸因于MPB-3BP@CM NPs的細胞攝取增強，以及MPB-3BP@CM NPs的化療/PTT聯(lián)合治療。此外，含3BP的制劑對HCT116細胞的殺傷效果明顯優(yōu)于不含3BP的其他制劑，顯示3BP介導(dǎo)的糖酵解抑制在體外誘導(dǎo)腫瘤細胞毒性中起重要作用。為了驗證MPB-3BP@CM NPs破壞腫瘤糖酵解途徑的功效，評估了MPB-3BP@CM NPs治療后不同時間培養(yǎng)的HCT116細胞中ATP和乳酸水平。經(jīng)過一段較長的時間(14小時)后，細胞表現(xiàn)出明顯的凋亡，同時ATP和乳酸水平顯著降低?？傊?，結(jié)果表明MPB3BP@CM NPs具有調(diào)節(jié)腫瘤糖酵解代謝的能力，并有效地減弱HCT116細胞中ATP和乳酸的產(chǎn)生(圖2g-i)。

圖2a-i|細胞的結(jié)合和攝取、體外毒性及抗腫瘤效果

03.細胞糖酵解途徑的調(diào)節(jié)

接下來對MPB-3BP@CM NPs (200 μg/mL)作用8小時的HCT116細胞進行了葡萄糖代謝物分析和轉(zhuǎn)錄譜分析。選擇這個特定的時間點是為了盡量減少凋亡過程可能產(chǎn)生的干擾。與對照組相比，3BP組和MPB-3BP@CM NPs組在細胞葡萄糖代謝物方面都表現(xiàn)出了顯著變化(圖2j)。ATP和乳酸含量的測量結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，從而驗證了之前結(jié)果的可靠性(圖2k)。令人驚訝的是，與糖酵解途徑相關(guān)的代謝物顯著積累，而與三羧酸循環(huán)途徑相關(guān)的代謝物顯著減少。此外，多種細胞能量代謝相關(guān)物質(zhì)，包括二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸鳥苷(GDP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)均顯著降低。根據(jù)KEGG通路分析(圖2l)，與代謝相關(guān)的差異表達基因主要富集于淀粉和蔗糖代謝、肌醇磷酸代謝、糖酵解/糖異生和半乳糖代謝。熱圖顯示了這些具有代表性的差異表達基因的表達水平(圖2m)。這些發(fā)現(xiàn)為MPB-3BP@CM NPs組中葡萄糖代謝物的差異提供了進一步令人信服的證據(jù)。

圖2j-m|MPB-3BP@CM NPs有效調(diào)節(jié)腫瘤糖代謝

04.誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)

腫瘤微環(huán)境（TME）中乳酸水平升高與促進血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫抑制有關(guān)，尤其重要的是與腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TME）的浸潤和激活有關(guān)?？紤]到MPB-3BP@CM NPs降低HCT116細胞乳酸生成的能力，研究了MPB-3BP@CMPs介導(dǎo)的腫瘤糖代謝的有效調(diào)節(jié)是否可以促進TAM向抗致瘤M1表型的極化。

在體外將RAW 264.7巨噬細胞與差異處理的HCT116癌細胞共培養(yǎng)。與對照組相比，MPB-3BP@CM NPs和MPB-3BP@CM NPs +激光組巨噬細胞中M1標(biāo)記物CD86水平升高，M2標(biāo)記物CD206水平降低(圖3a, b)。此外，細胞因子的定量(包括作為M1表型標(biāo)記的IL-12和IL-6，作為M2表型標(biāo)記的TGF-β和IL-10)進一步驗證了MPB-3BP@CM NPs介導(dǎo)的對腫瘤糖代謝的干擾在體外有效誘導(dǎo)了TAM向M1表型的極化(圖3c-f)。Balb/c裸鼠HCT116皮下腫瘤模型中收集腫瘤并進行流式細胞術(shù)分析進一步證實了MPB-3BP@CM NPs對高效極化TAM向M1表型的體內(nèi)影響。腫瘤切片免疫熒光染色顯示MPB-3BP@CM NPs +激光組M1巨噬細胞(CD86+)計數(shù)明顯升高；腫瘤組織中IL-6和IL-12 (M1標(biāo)記物)水平升高，TGF-β和IL-10 (M2標(biāo)記物)水平降低進一步證實了極化的增加（圖3i-p），表明特異性抗腫瘤免疫的增強得到有效實現(xiàn)，刺激巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力（圖3q)。

圖3|體外和體內(nèi)，MPB-3BP@CM nps誘導(dǎo)巨噬細胞極化和吞噬

02.拜譜小結(jié)

近年來，代謝研究一直是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一個突出課題。腫瘤細胞獨特的代謝模式賦予了腫瘤細胞惡性生物學(xué)特性。其中，糖酵解加劇，被稱為Warburg效應(yīng)，是由糖酵解酶失調(diào)驅(qū)動的一個標(biāo)志性特征。針對糖酵解過程中涉及的關(guān)鍵酶，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1 (GLUT1)、HK2、丙酮酸激酶M2 (PKM2)和乳酸脫氫酶(LDH)等酶的抑制，可以實現(xiàn)抑制腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃避、血管生成和耐藥的有效策略。雖然HK2抑制劑3BP顯示出對抗腫瘤的希望，但由于其烷基化性質(zhì)，其自由形式在全身給藥過程中存在不穩(wěn)定性。為了解決這一挑戰(zhàn)，本研究利用MPB NPs進行封裝為MPB-3BP@CM NPs，有效地提高了其穩(wěn)定性、生物相容性、循環(huán)時間、腫瘤蓄積等特點。這一過程中拜譜生物提供了能量代謝絕對定量技術(shù)，拜譜生物可提供完善成熟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及多組學(xué)聯(lián)合產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)體系，助力高分文章發(fā)表，歡迎咨詢！

參考文獻：Yang Y, Liu Q, Wang M, Li L, Yu Y, Pan M, Hu D, Chu B, Qu Y, Qian Z. Genetically programmable cell membrane-camouflaged nanoparticles for targeted combination therapy of colorectal cancer. Signal Transduct Target Ther. 2024 Jun 12;9(1):158. doi: 10.1038/s41392-024-01859-4.