圖1 研究思路

（圖源：Pauk?tyt? J et al., Molecular Cell, 2023）

一、老齡化相關(guān)結(jié)構(gòu)變化的全局分析

為了確定年齡相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)變化，本研究通過LiP-MS蛋白質(zhì)組對年輕和衰老的出芽酵母細(xì)胞進(jìn)行檢測，共鑒定出468種蛋白質(zhì)發(fā)生了年齡依賴性結(jié)構(gòu)差異。年齡相關(guān)結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更復(fù)雜的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，GO富集分析顯示這些蛋白主要參與代謝、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和氧化應(yīng)激等。與影響長壽的基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)抗長壽基因在年齡相關(guān)結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)中的比例更高，并且相關(guān)蛋白要富集于細(xì)胞質(zhì)翻譯和代謝過程，包括糖酵解和ATP產(chǎn)生?？傊挲g相關(guān)結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)普遍存在于衰老、代謝、生長和應(yīng)激反應(yīng)的相互調(diào)節(jié)中，并且在應(yīng)激條件下，這些結(jié)構(gòu)變化可以在可溶性和組裝態(tài)之間轉(zhuǎn)換。

圖2 年齡相關(guān)結(jié)構(gòu)變化蛋白質(zhì)的全局分析

（圖源：Pauk?tyt? J et al., Molecular Cell, 2023）

二、結(jié)構(gòu)變化確定了蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)物的活性變化

年齡相關(guān)結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)揭示了其在衰老過程的功能。熱休克蛋白（Hsp）家族的Hsp 40、Hsp 70、Hsp 90、Hsp100、Hsp110等都參與了衰老過程中蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持，其中Hsp70異構(gòu)體Ssa1的可用性在衰老過程中受到損害，但這種功能下降與結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚不清楚。因此，研究人員繪制了Ssa1結(jié)構(gòu)改變區(qū)域，發(fā)現(xiàn)聚集在兩個主要位點(diǎn)周圍：核苷酸結(jié)合域（NBD）和底物結(jié)合域（SBD）。此外，特異性tRNA修飾是否在衰老過程中發(fā)生改變尚不清楚，所以進(jìn)一步研究表明Trm1在tRNAs的G26位置催化N2,N2-二甲基鳥苷(m2, 2g)修飾，發(fā)現(xiàn)了年齡相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化，定位于保守基元II。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)LiP-MS可以促進(jìn)識別特定年齡相關(guān)的蛋白質(zhì)功能變化，并指導(dǎo)其機(jī)制分析。

圖3結(jié)構(gòu)變化反映了蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)物的活性變化

（圖源：Pauk?tyt? J et al., Molecular Cell, 2023）

三、衰老過程中谷氨酸合酶Glt1向中尺度裝配體的轉(zhuǎn)變

氨基酸代謝酶是一類最具代表性的年齡改變蛋白，為了評估該蛋白結(jié)構(gòu)變化是否會影響功能，本研究通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多酶都沒有檢測到與年齡相關(guān)的變化，但谷氨酸合成酶Glt1顯示出清晰而系統(tǒng)的年齡相關(guān)定位變化：在年輕細(xì)胞中，Glt1彌漫性分布在整個細(xì)胞質(zhì)中，但在衰老細(xì)胞中Glt1轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟮臈U狀結(jié)構(gòu)聚合物。這些聚合物以彌散的形式在細(xì)胞分裂時傳遞給子細(xì)胞，并且老化細(xì)胞中的Glt1聚合物是可以被逆轉(zhuǎn)的，其形成受到細(xì)胞內(nèi)谷氨酸水平和pH的調(diào)節(jié)。

圖4谷氨酸合成酶Glt1在衰老過程中形成可逆的絲狀聚合物

（圖源：Pauk?tyt? J et al., Molecular Cell, 2023）

四、抑制Glt1聚合延緩衰老，防止細(xì)胞內(nèi)氨基酸積累，并減輕線粒體功能障礙

隨后，作者研究了衰老相關(guān)的Glt1聚合對細(xì)胞壽命的影響。通過比較WT細(xì)胞與表達(dá)非聚合的GLT1MUT的復(fù)制壽命，發(fā)現(xiàn)聚合缺陷GLT1MUT細(xì)胞的中位壽命延長了20%。通過進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)，Glt1聚合狀態(tài)與氨基酸代謝有關(guān)，并且老化細(xì)胞中氨基酸水平的增加可能與Glt1聚合介導(dǎo)的氨基酸攝取有關(guān)。此外，作者發(fā)現(xiàn)年輕和衰老的WT或Glt1-mut細(xì)胞之間的標(biāo)記谷氨酸水平?jīng)]有差異，表明Glt1在聚合時保持其催化活性。最后，作者研究了Glt1聚合狀態(tài)與線粒體衰退之間的聯(lián)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高氨基酸條件下培養(yǎng)細(xì)胞降低了所有細(xì)胞群的線粒體膜電位，消除了年齡和聚合相關(guān)的差異。

圖5 Glt1聚合通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氨基酸的積累縮短了壽命

（圖源：Pauk?tyt? J et al., Molecular Cell, 2023）

本研究通過限制性酶切-質(zhì)譜分析（LiP-MS）對出芽釀酒酵母早期衰老過程中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了翻譯、蛋白質(zhì)折疊和氨基酸代謝調(diào)節(jié)因子中與年齡相關(guān)的功能變化。在機(jī)制上，發(fā)現(xiàn)折疊的谷氨酸合成酶Glt1在衰老過程中聚合成超分子自組裝，導(dǎo)致細(xì)胞氨基酸穩(wěn)態(tài)的破壞。通過改變聚合界面來抑制Glt1聚合，可以恢復(fù)衰老細(xì)胞中的氨基酸水平，減輕線粒體功能障礙，并延長壽命。LiP-MS是一種不需要化學(xué)修飾研究蛋白相互作用的新方法，共價結(jié)合與非共價結(jié)合靶點(diǎn)均可能檢出，能夠直接在復(fù)雜的生物環(huán)境中識別相互作用引發(fā)的結(jié)構(gòu)變化。拜譜最新推出限制性酶切-質(zhì)譜分析（LiP-MS），在蛋白處于天然構(gòu)象的條件下，用廣譜蛋白酶對其進(jìn)行酶切，并通過DIA掃描模式，結(jié)合高端的質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)Lip酶切肽段的高質(zhì)量檢出，進(jìn)而解析蛋白構(gòu)象變化，歡迎大家咨詢！