腸道是一個復(fù)雜的器官，里面充滿了多種微生物。隨著年齡的增長，腸道經(jīng)歷氧化應(yīng)激的可能性往往會增加。導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激的自由基有多種來源，包括正常的細(xì)胞代謝、炎癥過程、飲食因素、環(huán)境暴露和腸道菌群。與衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激加上抗氧化防御系統(tǒng)的功能下降可能對腸道屏障、腸道菌群和免疫功能產(chǎn)生不利影響。

蛋白質(zhì)半胱氨酸（Cys）修飾，例如S-次磺酸化（SOH）、S-亞磺酸化（SO2H）、S-磺酸化（SO3H）、S-谷胱甘肽化（SSG）、S-亞硝基化（SNO）和二硫鍵（S-S）等與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，并在細(xì)胞內(nèi)形成動態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。這些翻譯后修飾（PTM）以及Cys殘基的還原態(tài)（游離SH）共同維持細(xì)胞和器官的整體氧化還原平衡。Cys氧化還原修飾的失衡不僅是氧化應(yīng)激的指標(biāo)，還可能促進(jìn)腸道內(nèi)的氧化損傷，與腸道衰老和疾病發(fā)生相關(guān)。然而當(dāng)前仍然缺乏對Cys修飾的景觀、化學(xué)計量及其在腸道衰老過程中功能的系統(tǒng)探索。此外，氧化應(yīng)激和Cys修飾的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子在很大程度上仍然未知。

2025年1月8日，四川大學(xué)華西醫(yī)院戴倫治團(tuán)隊(duì)在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 40.8）上發(fā)表題目為“Low-input redoxomics facilitates global identification of metabolic regulators of oxidative stress in the gut”的文章，作者建立了一種高效、低樣本量的全局氧化還原修飾組學(xué)（redoxomics）技術(shù)流程，可以同時表征5種Cys氧化還原狀態(tài)。研究人員應(yīng)用此策略，以猴子、小鼠腸道組織為對象研究了與衰老相關(guān)的Cys氧化還原修飾譜，通過多組學(xué)整合分析揭示了腸道氧化應(yīng)激信號代謝調(diào)控機(jī)制。

研究結(jié)果

01全局Cys氧化還原修飾組的技術(shù)流程

為了獲得更全面的Cys氧化還原狀態(tài)，作者采取不同的前處理方法分別對不同的Cys修飾或游離SH進(jìn)行還原、生物素標(biāo)記、酶解，然后再利用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分不同處理的樣本即不同的修飾類型，肽段混合后進(jìn)行質(zhì)譜檢測（圖1）。此外，每個TMT批次中都包含一個通用參考樣本，作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的參照。作者利用該方法定量檢測了獼猴結(jié)腸組織中Cys氧化還原修飾譜，共獲得14,751個游離SH位點(diǎn)、14,794個總氧化修飾位點(diǎn)（Sto）、9,620個SOH位點(diǎn)、4,094個SNO位點(diǎn)和13,456個SSG位點(diǎn)。

圖1 高通量Cys氧化還原修飾組學(xué)分析的技術(shù)流程，覆蓋了游離自由基SH、SOH、SSG、SNO和總氧化（Sto）5種氧化修飾狀態(tài)

（圖源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

02衰老過程Cys氧化還原修飾化學(xué)計量特征

研究人員比較了幼年、中年、老年獼猴升結(jié)腸和降結(jié)腸組織氧化修飾蛋白譜，發(fā)現(xiàn)與腸道衰老相關(guān)的Cys修飾狀態(tài)。作者利用某個Cys位點(diǎn)上某種修飾占該位點(diǎn)總氧化修飾（Sto）和游離SH總和的相對含量來衡量該修飾的化學(xué)計量，即占有率。利用樣本中所有Cys修飾占有率的中位值來衡量該類型修飾的平均水平。研究發(fā)現(xiàn)老年升結(jié)腸和降結(jié)腸中SOH、SSG和SNO的平均水平顯著增加，其中SSG的化學(xué)計量顯著高于SOH和SNO，說明SSG修飾可能與腸道衰老更密切相關(guān)（圖2）。差異修飾位點(diǎn)所屬蛋白質(zhì)的通路富集分析揭示了SOH和SSG修飾的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞粘附和蛋白質(zhì)折疊，而SNO修飾的蛋白質(zhì)可能在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用（注：差異修飾位點(diǎn)的篩選是依據(jù)肽段強(qiáng)度而非占有率，通過ANOVA差異檢驗(yàn)）。研究結(jié)果還揭示了與腸道衰老相關(guān)的位置特異性Cys氧化還原調(diào)節(jié)，SSG修飾蛋白在降結(jié)腸的細(xì)胞-細(xì)胞粘附途徑中富集，但在升結(jié)腸中未富集?？傮w而言，研究提出了與非人靈長類動物腸道衰老相關(guān)的SOH、SSG和SNO修飾的特征和化學(xué)計量。

圖2 SSG、SOH、SNO三種Cys修飾占有率在不同年齡組中的密度圖分布

（圖源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

03Cys總氧化占有率的年齡相關(guān)變化

同樣作者利用Sto的占有率來評估不同分組間的Cys總體氧化水平，發(fā)現(xiàn)Sto的占有率呈現(xiàn)兩個峰值，隨著年齡的增長，這兩個峰值也會增加，表明老年組中Cys總體氧化水平更高。并對那些隨著年齡變化Sto占有率大幅增加或降低的Cys位點(diǎn)以及那些與年齡相關(guān)的差異Sto肽段所屬的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能富集分析，進(jìn)一步描繪了衰老相關(guān)的Cys氧化狀態(tài)的改變及其對細(xì)胞生物學(xué)過程和功能的效應(yīng)（圖3a-d）。

作者進(jìn)一步探究了氧化修飾是否賦予蛋白質(zhì)新的功能。將與年齡相關(guān)的Cys的Sto修飾位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝物組數(shù)據(jù)集進(jìn)行相關(guān)性分析，對相關(guān)性高的top50個Cys位點(diǎn)取交集獲得28個常見Cys位點(diǎn)（圖3e）。（注：兩組學(xué)數(shù)據(jù)的Spearman相關(guān)性分析是挖掘關(guān)鍵分子的常用方法，背后的邏輯是不同層次的組學(xué)往往是互相關(guān)聯(lián)的。Venn分析是進(jìn)一步縮小篩選范圍的常用策略。）通過在細(xì)胞水平對這些基因Cys突變?yōu)镾er，發(fā)現(xiàn)這些蛋白的非氧化狀態(tài)或氧化狀態(tài)在應(yīng)對氧化應(yīng)激方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖3f-h）。這表明Cys氧化不僅是氧化應(yīng)激的結(jié)果，而且還賦予這些蛋白質(zhì)新的功能，使它們能夠?qū)够虼龠M(jìn)氧化應(yīng)激。

圖3 與年齡相關(guān)的Cys氧化位點(diǎn)及其功能分析

（圖源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

04氧化應(yīng)激代謝調(diào)控因子的探究

越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激代謝調(diào)節(jié)的重要性。糖酵解、TCA循環(huán)和氧化磷酸化等代謝途徑會產(chǎn)生ROS副產(chǎn)物。代謝穩(wěn)態(tài)的破壞，例如過量的熱量攝入和營養(yǎng)失衡，會加劇氧化應(yīng)激。作者探究了代謝物與Cys氧化還原修飾相互作用在腸道衰老中的分子機(jī)制。通過對年齡相關(guān)的Cys修飾位點(diǎn)與不同年齡結(jié)腸代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)了與Sto水平正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的代謝物（圖4a-c）。（注：文章反復(fù)利用相關(guān)性分析挖掘兩組組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵分子）通過在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中添加篩選的代謝物，發(fā)現(xiàn)Sto負(fù)相關(guān)代謝物能抑制ROS的產(chǎn)生，Sto正相關(guān)代謝物能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生（圖4d）。（注：代謝組學(xué)常用的驗(yàn)證方法，直接小分子處理或者基因突變小分子代謝酶。）

為了進(jìn)一步探索這些代謝物對氧化應(yīng)激的影響，作者在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中利用Cys氧化修飾組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)評估了代謝物富馬酸對抗氧化應(yīng)激的能力。富馬酸處理下調(diào)了數(shù)百個Cys殘基的氧化水平，升結(jié)腸和降結(jié)腸的Sto化學(xué)計量幾乎恢復(fù)到同一水平，表明富馬酸抑制DSS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步揭示富馬酸顯著抑制免疫和炎癥反應(yīng)過程，促進(jìn)線粒體呼吸的蛋白質(zhì)表達(dá)，減輕ROS的產(chǎn)生。研究闡明了氧化還原修飾組和代謝組之間的全面交互，并確定了許多關(guān)鍵的代謝物，這些代謝物是腸道氧化應(yīng)激的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。（注：作者在靈長類動物中發(fā)現(xiàn)了代謝物與Cys修飾的交互作用，然后又在細(xì)胞和小鼠中驗(yàn)證代謝物的功能，同時用修飾組和蛋白質(zhì)組研究代謝物的作用機(jī)制，把代謝物→蛋白質(zhì)（修飾）→抗氧化應(yīng)激表型的邏輯關(guān)系闡述清楚了。）

圖4 衰老過程氧化應(yīng)激的代謝調(diào)控

（圖源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

05熱量限制（CR）飲食干預(yù)對腸道氧化還原信號的影響

CR是指在沒有營養(yǎng)不良的情況下有意識地減少卡路里攝入量，研究表明CR可減少 ROS的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激，從而可能延長壽命。作者在小鼠模型中探究了CR對腸道代謝和Cys氧化還原修飾組的影響。CR干預(yù)后差異表達(dá)的Cys肽段數(shù)量減少，Sto占有率降低。通路富集分析顯示CR干預(yù)后升結(jié)腸和降結(jié)腸中參與細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)Sto水平均降低。與細(xì)胞生長相關(guān)途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)如細(xì)胞周期、葡萄糖代謝和細(xì)胞分裂，也表現(xiàn)出Sto水平降低。代謝組學(xué)表明CR處理可以上調(diào)那些抗氧化的代謝物產(chǎn)生，如尿囊素、N-乙酰丙氨酸、富馬酸、吲哚乳酸和硫酸普拉酮等。

小結(jié)

綜上，本研究改進(jìn)了Cys氧化還原修飾組的分析方法，提高了效率和準(zhǔn)確性，同時減少了樣品投入和成本。另外，研究確定了各種Cys氧化還原修飾的化學(xué)計量，并分析了它們在腸道衰老過程中的動力學(xué)。本研究利用多組學(xué)分析策略，鑒定了許多氧化應(yīng)激關(guān)鍵內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。研究還發(fā)現(xiàn)CR 重新編程細(xì)胞代謝和Cys氧化還原修飾水平，可能影響腸道氧化應(yīng)激和腸道衰老（圖5）。

圖5 多組學(xué)分析氧化修飾調(diào)節(jié)腸道衰老的技術(shù)路線

（圖源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

拜譜小結(jié)

ROS會在Cys和蛋白質(zhì)骨架內(nèi)產(chǎn)生各種可逆的修飾。這些氧化翻譯后修飾可以參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活并調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。大量研究表明蛋白質(zhì)的氧化修飾與衰老、癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制有關(guān)，而且還在植物生長發(fā)育、新陳代謝、抗逆等的調(diào)控中扮演著重要角色。Cys修飾蛋白質(zhì)組學(xué)能全面的捕獲不同處理組間Cys氧化水平的變化，為研究氧化應(yīng)激參與疾病或發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供幫助。Cys修飾組和蛋白質(zhì)組、代謝組的多組學(xué)整合分析成為深入挖掘氧化應(yīng)激分子機(jī)制的研究利器。

這么多修飾類型，該怎么選呢？小編這里有幾點(diǎn)建議，供參考：

（1）看修飾酶的表達(dá)變化，比如棕櫚?；揎椕竄DHHC、亞硝基化修飾酶NOS、谷胱甘肽去修飾酶Grx1等；

（2）看底物的變化，比如棕櫚酸化底物棕櫚酰-CoA、亞硝基化底物NO、谷胱甘肽化影響因素GSH/GSSH比值、硫巰基化底物H2S、次磺酸化底物ROS等；

（3）如果沒有特定的影響因素，我們可以選擇total氧化還原修飾，無差別檢測Cys所有修飾。

拜譜生物作為國內(nèi)領(lǐng)先的多組學(xué)技術(shù)服務(wù)公司，在氧化還原修飾蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域深耕多年，是國內(nèi)首家開展棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)組服務(wù)的公司，現(xiàn)已推出了半胱氨酸7大修飾產(chǎn)品，包括棕櫚?；?、亞硝基化、谷胱甘肽化、硫巰基化、次磺酸化、total氧化還原和游離巰基，并助力發(fā)表了一系列高水平文章，包括Nature、Molecular Cancer等。此外，拜譜生物新開發(fā)的Cys-Tag標(biāo)記方法，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)半胱氨酸氧化還原修飾的全局檢測，一次檢測可對多種修飾同時表征。歡迎咨詢！

參考文獻(xiàn)：

Xiao, X., Hu, M., Gao, L. et al. Low-input redoxomics facilitates global identification of metabolic regulators of oxidative stress in the gut. Sig Transduct Target Ther 10, 8 (2025). https://doi.org/10.1038/s41392-024-02094-7B1