前言

細胞內部區(qū)室化是人類細胞結構的基本特征，以細胞器為單位的細胞區(qū)室化對于細胞空間構成、行使獨立的細胞功能、隔離有害化學物質等細胞生物過程至關重要。細胞區(qū)室化通過細胞組分動態(tài)的亞細胞定位控制細胞生物學過程，從而參與細胞與環(huán)境的互作。因此，認識細胞器的分子組成，特別是蛋白質的組成，以及這種組成如何在細胞狀態(tài)之間重塑仍然是人類細胞生物學的一個主要目標。過往基于成像或質譜表征細胞器蛋白質組的研究方法仍存在鑒定深度低、操作繁瑣、只能分析少數細胞器等局限性。

2025年1月2日，Cell期刊在線發(fā)表了扎克伯格Biohub研究所Manuel D. Leonetti團隊的文章 “Global organelle profiling reveals subcellular localization and remodeling at proteome scale”。本研究基于細胞器免疫捕獲與質譜聯用開發(fā)了一種高分辨率繪制亞細胞級蛋白質組圖譜的工作流程。研究人員利用此流程獲得了人類細胞全區(qū)室細胞器蛋白質組圖譜，注釋了 7,600 多種蛋白質的亞細胞定位，并定義了細胞空間網絡，揭示了細胞區(qū)室之間的關聯。該方法可以用于全面分析細胞擾動期間的蛋白質組重塑。作者通過表征 HCoV-OC43 病毒感染后的細胞景觀，表明亞細胞重塑的蛋白質組分析為闡明細胞生物學過程提供了關鍵見解。本研究數據集可以在organelles.czbiohub.org開放獲取。

研究結果

01、基于細胞器免疫捕獲的全細胞區(qū)室蛋白質組檢測流程

簡單來說，該流程就是基于免疫捕獲的方法獲得細胞內所有區(qū)室（compartments），然后通過質譜的方法對富集的區(qū)室蛋白質組進行表征。作者給所有的區(qū)室分配了特異性marker蛋白，包括有細胞質膜的細胞器、無膜的區(qū)室以及胞質聚集體，共37個marker蛋白和19個細胞區(qū)室（圖1D）。首先是通過CRISPR-Cas9給每個細胞器的marker基因添加了表位標簽（作為“釣餌”）：linker-GFP-3xHA（圖1A）。通過流式細胞分選，獲得表達細胞器marker蛋白的細胞文庫（圖1B）。然后在天然溫和條件下進行細胞裂解，保持細胞器完整性，用免疫沉淀捕獲帶有標簽的細胞區(qū)室，用分段離心的方法獲得那些未標記的細胞核、膜結合細胞器以及胞漿部分（圖1CD）。質譜分析的蛋白質組通過試劑對照和IgG對照，選取差異倍數2倍，P≤0.01的蛋白作為細胞區(qū)室富集的蛋白質組。

圖1 本研究所采用的全細胞區(qū)室蛋白質組檢測流程

（圖源：Hein et al., Cell, 2025）

02、繪制亞細胞級別的人類蛋白質組圖譜

基于上述方法作者獲得HEK293T細胞的全細胞區(qū)室蛋白質組數據集，共釣取8,538個蛋白（圖2A）。蛋白質Pearson相關性分析表明同一細胞器內的蛋白高度相關聯，部分細胞內直接互作的細胞器的蛋白質也呈現中度的關聯，比如內質網和線粒體蛋白（圖2B）。另外，細胞內互作蛋白也能呈現高度相關性或共富集。

為了進一步挖掘富集蛋白組的特征，作者參考了單細胞轉錄組降維的思想，采用K-最鄰近（K-NN）算法對高維的全細胞區(qū)室蛋白質組數據矩陣進行降維分析。結合GO數據庫亞細胞定位富集分析，最后利用正則化為每個蛋白質分配其相鄰蛋白中最具代表性的標記（圖2C）。經過聚類分析，作者獲得了HEK293T細胞二維的亞細胞蛋白質圖譜UMAP圖（圖2D）。該圖譜注釋了20個獨立的亞細胞區(qū)室，區(qū)室的分布符合已知的生物學過程，比如內質網、高爾基體、內體、細胞膜蛋白質的分布關系與細胞分泌系統(tǒng)一致。

基于前期公布的亞細胞蛋白質組數據集，作者構建了機器學習分類器來驗證基于降維圖形化注釋結果的準確性，結果顯示AUC≥0.93。作者還基于最全面的線粒體蛋白質組數據庫評價了本研究的注釋召回率在所有已公布數據集中最高（77%）?？傊髡咄ㄟ^與過往亞細胞蛋白質組數據進行比較分析，驗證了本研究注釋結果的客觀真實性。

圖2 人類亞細胞蛋白質組圖譜的圖形化呈現

（源自：Hein et al., Cell, 2025）

03、亞細胞蛋白網絡定義功能特征并量化細胞器連接

亞細胞蛋白質圖譜中的k-NN map是某個蛋白與其鄰近的20個蛋白的網絡圖，從k-NN map中能挖掘蛋白功能信息。作者以WASHC5為例進行了說明，這是一個負責內體-高爾基體-溶酶體系統(tǒng)分子轉運的調節(jié)因子，k-NN map顯示WASHC5定位于內體-高爾基體-溶酶體的中心交界處（圖3A）。與其相連的蛋白分別是Retromer和Commander復合物（圖3B），也反映了WASHC5與Retromer或Commander復合物關聯，從而運輸不同分子的功能。總而言之，該示例表明了如何挖掘 k-NN map的詳細結構以進行功能探索。

細胞器間通訊是細胞生理學的重要組成部分。作者利用不同亞細胞cluster之間的k-NN連接數量即連接密度對亞細胞區(qū)室之間的聯系進行度量（圖3C）。為了進一步注釋細胞器之間的關聯，作者在k-NN map中鑒定了那些界面蛋白，并認為這些界面蛋白是負責連接不同細胞器的關鍵蛋白（圖3D,E）。通過這種方法，作者準確識別了許多專門用于囊泡系統(tǒng)內界面運輸或調節(jié)的蛋白質（圖3F）。

圖3 蛋白質空間網絡識別協同功能蛋白質和細胞器界面

（源自：Hein et al., Cell, 2025）

04、HCoV-OC43病毒感染導致的泛細胞重塑（pan-cellular remodeling）

為了獲得外界擾動對細胞內環(huán)境重塑的全面性認識，作者基于上述方法研究了HCoV-OC43病毒感染條件下的全局細胞器蛋白質組。感染后48h取樣，分析了28個免疫捕獲細胞器和3個分段離心的蛋白質組。將亞細胞蛋白質組轉換成k-NN map，再通過aligned-UMAP算法將感染和非感染亞細胞蛋白質組整合（圖4A）。每個蛋白賦予其亞細胞重塑得分來衡量感染后蛋白的亞細胞重定位。根據亞細胞重塑得分獲得感染相關的633個蛋白，UMAP圖和?；鶊D顯示這633個蛋白的亞細胞環(huán)境發(fā)生顯著的改變（圖4D-E），表明病毒感染導致了細胞內環(huán)境的全局性重塑。其中ERGIC、中心體、內質網、高爾基體中呈現最高的亞細胞重塑（圖4F）：這與已知的冠狀病毒在內質網/高爾基體界面復制和組裝的細胞生物學相匹配。活細胞共聚焦顯微鏡成像也表明高爾基體、內質網和圍觀網絡在病毒感染后發(fā)生明星的亞細胞重塑（圖4G-H）

圖4 HCoV-OC43感染引起的泛細胞重塑

（源自：Hein et al., Cell, 2025）

05、亞細胞重塑重新定義病毒感染的細胞生物學過程

作者比較了亞細胞蛋白質組和基因表達水平的蛋白質組或轉錄組，發(fā)現二者只有少部分的交集，表明了功能調節(jié)的正交模式，即許多蛋白質在其空間環(huán)境水平上受到動態(tài)調節(jié)，而不是受到細胞豐度變化的調節(jié)。亞細胞重塑蛋白質功能富集分析揭示了病毒感染相關的糖胺聚糖代謝、鐵死亡、自噬和細胞衰老通路（圖5A-B）。作者進一步驗證了鐵死亡在促進病毒感染過程中的作用（圖5C-D）。有意思的是，作者同k-NN map分析發(fā)現鐵死亡通路上的蛋白NCOA4亞細胞環(huán)境發(fā)生顯著變化，病毒感染后NCOA4相鄰的蛋白變?yōu)榧せ睢⒀娱L的自噬體相關因子，揭示了鐵蛋白自噬激活在 OC43 感染的細胞生物學中的作用（圖5F）。

圖4 HCoV-OC43感染引起非豐度變化的細胞反應

（源自：Hein et al., Cell, 2025）

小結

綜上所述， 本研究創(chuàng)建了一套亞細胞蛋白質組表征和動力學分析的工作流程，包含了實驗部分和數據分析。首先基于全細胞器的marker蛋白，利用免疫捕獲收集全細胞器，并進行質譜檢測，獲得亞細胞蛋白質組數據矩陣；然后開發(fā)了基于圖形的數據分析流程，用來識別蛋白質的功能關系和亞細胞定位注釋，獲得亞細胞蛋白質組圖譜；最后應用該工作流程研究了細胞在外界擾動下的亞細胞蛋白質組動態(tài)特征和亞細胞環(huán)境重塑。以HCoV-OC43病毒感染細胞為例，本工作流程揭示了非蛋白豐度改變的亞細胞重塑細胞反應，推動了對病毒感染細胞生物學的認識。

拜譜小結

從亞細胞重塑的角度理解細胞與環(huán)境的互作，為進一步認識疾病相關的病理和生理機制，發(fā)現疾病治療靶點提供了新的科學依據。隨著技術的進步，從bulk蛋白質組到單細胞蛋白質組，再到如今的亞細胞蛋白質組，分辨率越來越高，促進了從不同維度和層次下識別蛋白質的動態(tài)特征。Bulk蛋白質組識別組織或細胞樣本平均的蛋白表達水平，單細胞蛋白質組則更關注的是樣本中的細胞異質性，那么亞細胞蛋白質組則告訴我們細胞內環(huán)境蛋白分子的空間變化信息，即亞細胞定位的重塑。

拜譜生物作為國內領先的多組學公司，可提供完善成熟的蛋白組學、代謝組學、轉錄組學等多組學產品技術服務體系。其中本司開發(fā)了高深度的DIA-蛋白質組、極微量蛋白質組、單細胞蛋白質組和空間蛋白質組，可助力研究人員開展不同尺度下的蛋白質組學研究，揭示蛋白分子動態(tài)規(guī)律和微觀空間特征。DIA-蛋白質組適用于常規(guī)樣本，檢測深度更高、重復性更好、靈敏度更高；極微量蛋白質組適用于原代細胞、卵母細胞、臨床穿刺樣本等微量樣本的蛋白質組學研究；單細胞蛋白質組通常結合單細胞轉錄組進行研究，不僅能對單細胞轉錄組的結果進行驗證，還能獲得蛋白質層面的表達信息；空間蛋白質組可實現對病理切片中特定空間位置組織微環(huán)境在成像及蛋白表達等層面進行系統(tǒng)的定位、定性和定量分析，揭示組織微環(huán)境高度異質性、不同細胞類型的空間分布。歡迎咨詢！

參考文獻：

Hein MY, Peng D, Todorova V, et al. Global organelle profiling reveals subcellular localization and remodeling at proteome scale. Cell. Published online December 26, 2024. doi:10.1016/j.cell.2024.11.028