肉的宰后嫩化主要歸因于肌原纖維結構的破壞，肌原纖維結構是由內源性蛋白水解酶降解肌原纖維和細胞骨架蛋白造成的。與幾十年來一直是關注焦點的鈣蛋白酶不同，胱天蛋白酶（caspases）最近成為感興趣的話題。胱天蛋白酶在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著至關重要的作用，其中caspase-3在死后蛋白水解中的作用是多方面和復雜的，因此值得進一步研究。S-亞硝基化通過調節(jié)鈣釋放、能量代謝、蛋白質降解和細胞凋亡來調節(jié)肉質，包括嫩度和持水能力。前期研究發(fā)現(xiàn)S-亞硝基化可以下調依賴線粒體的caspase-3級聯(lián)反應，這可能是肌肉細胞凋亡和牛肉品質變化的原因。caspase-3的研究重點是其與細胞凋亡的關系，然而，很少有研究探討S-亞硝基化調節(jié)caspase-3的機制。

2024年9月由南京農(nóng)業(yè)大學張萬剛教授團隊在期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry發(fā)表題為“Exploring the Effects of S?Nitrosylation on Caspase?3 Modification and Myofibril Degradation of Beef In Vitro”文章，研究發(fā)現(xiàn)了GSNO處理后caspase-3的活性顯著降低（P < 0.05），并表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，其在半胱氨酸116、170、184、220和264位點被S-亞硝基化，進一步抑制了其對牛肉肌原纖維蛋白的蛋白水解能力。拜譜生物為該研究提供了亞硝基化修飾組學檢測服務，助力發(fā)現(xiàn)目的蛋白上的亞硝基化修飾位點。

中文標題：體外研究S-亞硝基化對牛肉Caspase-3修飾和肌原纖維降解的影響

期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry

2024年影響因子：5.7

發(fā)表時間：2024年9月

客戶單位：南京農(nóng)業(yè)大學

研究材料：蛋白

拜譜提供技術：亞硝基化修飾組學

技術路線：

一、研究結果

01.Caspase-3活性

目前尚不清楚NO對caspase-3的抑制作用是否歸因于NO介導的S-亞硝基化，不同濃度梯度的GSNO作為外源性NO供應，以誘導caspase-3的體外S-亞硝基化。結果表明，與沒有GSNO的組相比，100、200和400μM GSNO組的caspase-3活性顯著降低（圖1），與先前報道一致。GSNO處理降低caspase-3活性的潛在原因仍有待闡明。

圖1 不同濃度的GSNO處理對caspase-3活性的影響

(圖源：Hou, Qin et al., J Agric Food Chem.. 2024)

02.Caspase-3的S-亞硝基化程度

研究Caspase-3的亞硝基化程度，以闡明GSNO對Caspase-3的反應性。經(jīng)GSNO處理后，檢測到caspase-3蛋白S-亞硝基化強度增加（圖2）。這些結果表明，外源性GSNO培養(yǎng)可成功誘導caspase-3的體外S-亞硝基化。令人驚訝的是，在沒有GSNO存在的對照組中檢測到一個微弱的S-亞硝基化帶，這表明caspase-3可能發(fā)生內源性的S-亞硝基化。此外，本研究中caspase-3的S-亞硝基化程度較高，而caspase-3的活性降低，這與之前的研究一致。然而，caspase-3的特異性S-亞硝基化修飾位點尚不清楚，還需要進一步的探索。

圖2 GSNO處理對caspase-3S-亞硝基化水平的影響

(圖源：Hou, Qin et al., J Agric Food Chem.. 2024)

03.Caspase-3的S-亞硝基化位點

通過亞硝基化修飾組學檢測caspase-3的S-亞硝基化位點。結果表明，caspase-3上的4個多肽中有5個半胱氨酸殘基被蛋白S-亞硝基化修飾（圖3）。亞硝基化半胱氨酸定位于SSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLK,GTELDCGIETDSGVDDDMACHKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWR,DGSWFIQSLCAMLK和KQIPCIVSMLTK的多肽中，分別位于116、170、184、220和264位。S-亞硝基化caspase-3多肽的MS1和MS2光譜顯示Caspase-3是一種具有8個半胱氨酸殘基的半胱氨酸蛋白酶，其中5個半胱氨酸被發(fā)現(xiàn)被亞硝基化，說明Caspase-3易受亞硝基化修飾（圖4）。此外，據(jù)先前報道casase-3的催化殘留亞硝基化Cys163，這不同于本研究的結果。S-亞硝基化caspase-3的豐度、位點的修飾水平和檢測方法的靈敏度的差異可能是導致結果不一致的原因之一。可以推斷，半胱氨酸蛋白酶活性的調節(jié)可能是由NO和蛋白S-亞硝基化介導的，這可能影響蛋白降解，促進死后衰老。

圖 3 caspase-3的序列。藍色標記的序列表示S-亞硝基化肽，紅色標記的C表示S-亞硝基化半胱氨酸

(圖源：Hou, Qin et al., JAgric Food Chem.. 2024)

圖4. s-亞硝基化肽和caspase-3位點的MS1和MS2光譜

(圖源：Hou, Qin et al., J Agric Food Chem.. 2024)

04.S-亞硝基化Caspase-3降解結蛋白

結蛋白作為一種重要的細胞骨架蛋白，在維持肌細胞結構的結構完整性和收縮性方面起著重要作用，研究S-亞硝基化caspase-3對結蛋白降解的敏感性具有重要意義。與Std（未用胱天蛋白酶-3和GSNO孵育的初始肌纖維蛋白）組相比，0 μM GSNO組（肌原纖維和caspase-3的孵育，無GSNO）的完整結蛋白含量顯著降低，提示caspase-3對結蛋白具有潛在的蛋白水解能力。在GSNO孵育后，完整結蛋白的含量明顯增加（P < 0.05）。此外，當GSNO濃度升高時，完整結蛋白的含量持續(xù)上調（P < 0.05）（圖5）。這一發(fā)現(xiàn)表明，SNO修飾的caspase-3以水平依賴的方式抑制結蛋白的降解。

圖5.S-亞硝基化caspase-3降解結蛋白

(圖源：Hou, Qin et al., J Agric Food Chem.. 2024)

05.S-亞硝基化Caspase- 3降解肌鈣蛋白-T

肌鈣蛋白-T (TnT)是原肌球蛋白調節(jié)負責肌肉收縮的細絲的必需肌原纖維蛋白。TnT的降解特征是檢測到28和30 kDa的TnT。在亞硝基化條件下，caspase-3對TnT的降解情況如圖6所示，與Std組（不含caspase-3和GSNO的肌原纖維）相比，caspase-3組中30 kDa TnT片段顯著增加，表明caspase-3參與了TnT的降解，此外，caspase-3與GSNO的孵育導致30 kDa TnT下降。在100和200 μM GSNO組之間沒有檢測到明顯的差異(P > 0.05)，而當GSNO的濃度達到400 μM 時，該片段顯著減少(P < 0.05)。這些發(fā)現(xiàn)表明了SNO修飾的caspase-3對TnT降解的抑制作用。結蛋白和TnT是caspase-3的敏感底物，而GSNO處理降低caspase-3的活性可能導致肌原纖維蛋白降解程度降低。綜上所述，NO誘導的S-亞硝基化可以通過修飾半胱氨酸殘基來調節(jié)caspase-3的活性，進而進一步影響其對結蛋白和TnT的蛋白水解能力，從而影響牛肉品質。

圖6. S-亞硝基化caspase- 3降解肌鈣蛋白-T

(圖源：Hou, Qin et al., J Agric Food Chem.. 2024)

二、小結

本研究旨在探討S-亞硝基化對caspase-3修飾的影響及其隨后對牛肉肌原纖維體外降解的影響。蛋白S-亞硝基化可以修飾caspase-3的半胱氨酸殘基，從而導致caspase-3活性降低，進一步抑制了其對牛肉肌原纖維蛋白的蛋白水解能力。

三、拜譜小結

研究采用了酶活測定，亞硝基化修飾組學分析，WB等檢測手段，發(fā)現(xiàn)蛋白S-亞硝基化可以修飾caspase-3的半胱氨酸殘基，這導致了caspase-3活性的降低，并進一步抑制了其對牛肉肌原纖維蛋白的蛋白水解能力。本研究為解釋蛋白質亞硝基化對肉質的調控機制提供了一個新的視角。

拜譜生物作為一家國內領先的多組學服務公司，可提供完善成熟的蛋白質組學、修飾蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學等多組學產(chǎn)品技術服務體系，整合多組學數(shù)據(jù)進行深入挖掘分析，全面解析機制機理等，助力高分文章發(fā)表。除此之外，拜譜生物還可提供半胱氨酸系列產(chǎn)品，包括亞硝基化、谷胱甘肽化、硫巰基化、次磺酸化、total氧化還原、游離巰基，歡迎大家咨詢！

參考文獻：

Qin Hou, Chao Ma, Rui Liu, Zhuangli Kang, and Wangang Zhang.Exploring the Effects of S-Nitrosylation on Caspase-3 Modification and Myofibril Degradation of Beef In Vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry. doi.org/10.1021/acs.jafc.4c06663