光照和溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的兩種重要的環(huán)境因素，它們不僅影響植物的形態(tài)建成，還調(diào)控著植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。ELONGATED HYPOCOTOYL5（HY5）和PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs（PIFs）是兩種重要的植物生長(zhǎng)的光調(diào)控因子，它們之間的相互作用尚不明確。

2024年8月由中國(guó)浙江大學(xué)周艷虹教授團(tuán)隊(duì)在知名期刊PNAS發(fā)表題為“SlCPK27 cross-links SlHY5 and SlPIF4 in brassinosteroid-dependent photo- and thermo-morphogenesis in tomato”文章，研究發(fā)現(xiàn)，激活的番茄HY5（SlHY5）會(huì)觸發(fā)一個(gè)鈣依賴蛋白激酶SlCPK27的轉(zhuǎn)錄。SlCPK27與SlPIF4相互作用，并在Ser-252和Ser-308磷酸化位點(diǎn)上對(duì)其進(jìn)行磷酸化，以促進(jìn)其降解。SlPIF4主要通過(guò)激活油菜素內(nèi)酯（BR）生物合成中的一個(gè)關(guān)鍵基因SlDWF的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)。這種SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR級(jí)聯(lián)反應(yīng)不僅在光形態(tài)建成中起著至關(guān)重要的作用，還調(diào)節(jié)熱形態(tài)建成。拜譜生物為該研究提供了RNA-seq技術(shù)服務(wù)。

英文標(biāo)題：SlCPK27 cross-links SlHY5 and SlPIF4 in brassinosteroid-dependent photo- and thermo-morphogenesis in tomato（PNAS，2024.08）

中文標(biāo)題：SlCPK27在番茄中通過(guò)油菜素內(nèi)酯依賴的光和熱形態(tài)建成中交叉連接SlHY5和SlPIF4

客戶單位：浙江大學(xué)

研究材料：番茄幼苗

拜譜提供技術(shù)：RNA-seq

技術(shù)路線：

一、研究結(jié)果

01. SlCPK27基因的發(fā)現(xiàn)和功能確定

前期研究通過(guò)RT-qPCR發(fā)現(xiàn)SlCPK27表達(dá)量在白光(W)、藍(lán)色(B)、紅色(R)和遠(yuǎn)紅色(FR)照射下均出現(xiàn)了顯著的上升，光感受器突變植株與WT相比，該基因的上升幅度顯著下降或不出現(xiàn)上升，說(shuō)明該基因與植株光感是緊密相關(guān)的（圖1 A~C）。

為了研究SlCPK27是否在光形態(tài)建成中起作用，在黑暗和光照條件下培養(yǎng)了兩個(gè)純合子系sicpk27 #2和sicpk27 #6。SlCPK27突變體在黑暗條件下的下胚軸長(zhǎng)度與WT相似，但在光照條件下的下胚軸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于WT。

02.SlCPK27基因與HY5相互作用研究

針對(duì)光形態(tài)建成重要調(diào)節(jié)因子HY5的研究中發(fā)現(xiàn)，其具有與SlCPK27相似的光響應(yīng)趨勢(shì)，在HY5突變植株slhy5 #1和slhy5 - oe的研究中發(fā)現(xiàn)，后者植株的下胚軸明顯短于WT和slhy5 #1（圖2），并發(fā)現(xiàn)slhy5 #1突變體中SlCPK27的光誘導(dǎo)表達(dá)受到抑制，但與WT相比，slhy5 - oe幼苗中SlCPK27的光誘導(dǎo)表達(dá)顯著增加（圖1D），并進(jìn)行了電泳遷移轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(EMSA)，發(fā)現(xiàn)his標(biāo)記的SlHY5蛋白可以與SlCPK27的啟動(dòng)子結(jié)合（圖1E）。

后續(xù)使用雙熒光素酶(LUC)報(bào)告系統(tǒng)在煙葉中進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SlHY5顯著增強(qiáng)了SlCPK27的啟動(dòng)子活性(圖1G)。

為了驗(yàn)證SlCPK27和SlHY5之間的遺傳相互作用，培育了對(duì)應(yīng)的雙突變體，發(fā)現(xiàn)其下胚軸長(zhǎng)度與SlCPK27突變體接近（圖1H）。

圖1 SlCPK2與SIHY5相互作用(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Aca

圖2 SIHY5突變植株HY5表達(dá)與植株萌發(fā)情況

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

03.SlCPK27基因與SlPIF4相互作用研究

為了解決slhy5調(diào)控SlCPK27如何抑制下胚軸伸長(zhǎng)的問(wèn)題，進(jìn)一步研究SlCPK27和SlHY5之間的相互作用，作者對(duì)WT、SlHY5和SlCPK27幼苗在W光下生長(zhǎng)4 d進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。比值≥2或≤0.5，p值< 0.05的轉(zhuǎn)錄本被鑒定為差異表達(dá)基因（DEG）。基于這一標(biāo)準(zhǔn)，作者鑒定了416個(gè)SlCPK27調(diào)控的DEG和890個(gè)SlHY5調(diào)控的DEG（圖3）。

作者通過(guò)酵母雙雜交(Y2H)篩選來(lái)確定SlCPK27的潛在相互作用伙伴，在90個(gè)候選物中重點(diǎn)研究了與光信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PIF4，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SlCPK27和SlPIF4之間的相互作用（圖4A），后使用Pull-down，雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了二者的互作關(guān)系，并在Ca2+處理后增強(qiáng)（圖4D）。

在植物體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，在slcpk27突變體在光照下的SlPIF4蛋白在核、質(zhì)積累要比WT高得多(圖4E,F)，SlPIF4的光誘導(dǎo)降解被26S蛋白酶體抑制劑MG132抑制，這表明SlCPK27通過(guò)26S蛋白酶體途徑促進(jìn)了SlPIF4的光誘導(dǎo)降解（圖4G）。

通過(guò)生成slpif4突變株和slcpk27/slpif4雙突變株，發(fā)現(xiàn)二者相較于WT和slcpk27突變株，均表現(xiàn)出了短下胚軸的性狀（圖4H）。

圖3 SlCPK27和SlHY5共調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄組分析

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

圖4.SlCPK27與SlPIF4相互作用

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

PIF蛋白磷酸化是光誘導(dǎo)PIF蛋白降解的先決條件，考慮到光觸發(fā)Ca2+流入細(xì)胞質(zhì)以促進(jìn)植物的光形態(tài)建成，使用黃化苗進(jìn)行CaCl2處理和H2O對(duì)照探究了Ca2+對(duì)該過(guò)程的影響，發(fā)現(xiàn)CaCl2處理增強(qiáng)了光誘導(dǎo)SlPIF4磷酸化，但EGTA和LaCl3處理抑制了SlPIF4磷酸化；考慮到cpk作為Ca2+信號(hào)解譯器，作者隨后通過(guò)使用體外磷酸化反應(yīng)后純化的大腸桿菌His-SlCPK27和MBPSlPIF4蛋白進(jìn)行phos標(biāo)簽遷移轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，探索SlCPK27是否直接磷酸化SlPIF4。在His-SlCPK27存在的情況下，觀察到MBP-SlPIF4的遷移率移位帶，表明SlPIF4在體外被SlCPK27磷酸化（圖5A）

Ca2+和光刺激進(jìn)一步促進(jìn)了這種磷酸化(圖5B,C)，同時(shí)，使用抗pSer /pThr抗體進(jìn)行免疫印跡分析顯示，SlCPK27-GFP磷酸化水平和激酶活性在光照后5分鐘內(nèi)增加(圖5E)。這些數(shù)據(jù)共同揭示了SlCPK27以Ca2+和光依賴的方式磷酸化SlPIF4。

圖5 SlCPK27磷酸化SlPIF4有助于光誘導(dǎo)SlPIF4蛋白降解

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

04.油菜素內(nèi)酯(BR)在SlCPK27調(diào)控光形態(tài)形成中的作用

生長(zhǎng)素和BR在pif4調(diào)控的下胚軸伸長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用，slpif4突變體在光照條件下，CS、BL和吲哚-3-乙酸(IAA)含量明顯低于WT(圖6A-C)，使用24-表油菜素內(nèi)酯(eBL)和合成生長(zhǎng)素picloram (Pic)來(lái)區(qū)分BR和生長(zhǎng)素在slpif4調(diào)控的下胚軸伸長(zhǎng)中的作用。eBL顯著促進(jìn)了WT的下胚軸伸長(zhǎng)，Pic僅部分挽救了slpif4的下胚軸缺陷表型（圖7）。

轉(zhuǎn)錄組和RT-pcr結(jié)果顯示slpif4突變體中SlDWF的轉(zhuǎn)錄物積累量減少，但與WT相比，其他BR生物合成基因的轉(zhuǎn)錄物積累量沒(méi)有明顯變化（圖6D）。為了驗(yàn)證SlPIF4是否直接調(diào)控SlDWF的表達(dá)，作者進(jìn)行了EMSA，發(fā)現(xiàn)MBP-SlPIF4可以結(jié)合SlDWF的啟動(dòng)子在所有g(shù) -box樣基序上(圖6E)，并使用ChIP進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證（圖6F）。

在突變植株研究中發(fā)現(xiàn)，sldwf突變體的下胚軸較短，而SlDWF過(guò)表達(dá)(sldwf - oe)系的下胚軸較長(zhǎng)。重要的是，slcpk27突變體(slcpk27 SlDWF)中SlDWF的突變破壞了slcpk27的長(zhǎng)下胚軸表型，而slpif4中SlDWF的過(guò)表達(dá)恢復(fù)了slpif4的短下胚軸表型（圖6H）。

圖6 SlPIF4通過(guò)觸發(fā)BR生物合成負(fù)調(diào)控光形態(tài)建成

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

圖7 BR和生長(zhǎng)素在slpif4介導(dǎo)的下胚軸生長(zhǎng)中的作用

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

05.SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR模塊在熱形態(tài)建成中的作用

除了光，溫度也是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境線索，為了確定SlHY5-SlCPK27-SlPIF4模塊是否也參與熱形態(tài)建成的調(diào)控，將光感受器突變體(slphyA、slphyB1B2、slphyAB1B2和slcry1a)在25℃或32℃的光照下培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)溫暖環(huán)境下WT下胚軸顯著增長(zhǎng)，但是這一現(xiàn)象在突變體中均減弱或消失（圖8A,B），此外，溫暖的溫度降低了SlHY5蛋白的積累，但增加了SlPIF4蛋白在WT幼苗中的積累(圖8C)，溫暖溫度顯著降低了SlCPK27的轉(zhuǎn)錄量，增加了SlDWF的轉(zhuǎn)錄量，上述變化在突變體中也有所減弱，證實(shí)了以上光感受器和SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR通路在植株熱形態(tài)調(diào)控中的作用。

雖然溫度顯著影響了WT下胚軸長(zhǎng)度，但對(duì)slhy5和slcpk27突變體的下胚軸長(zhǎng)度影響甚微，而對(duì)slpif4和sldwf突變體的下胚軸長(zhǎng)度沒(méi)有顯著影響（圖8F,G），這一現(xiàn)象強(qiáng)調(diào)了SlHY5-SlCPK27-SlPIF4模塊通過(guò)調(diào)節(jié)BR生物合成在熱形態(tài)建成中的重要作用。

圖8 SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR模塊參與番茄熱形態(tài)建成

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

二、文章小結(jié)

光形態(tài)和熱形態(tài)是植株萌發(fā)初期重要的調(diào)控，本文章通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和WB實(shí)驗(yàn)探究了Ca2+參與光信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)下游信號(hào)通路SlHY5-SlCPK27-SlPIF4-BR誘導(dǎo)植株下胚軸伸長(zhǎng)的過(guò)程和相關(guān)過(guò)程中的調(diào)控，如Ca2+流動(dòng)和磷酸化等。這種多用途信號(hào)模塊表明，光和溫度信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能協(xié)同進(jìn)化，從而賦予植物更大的靈活性，微調(diào)其生理過(guò)程，以更好地適應(yīng)環(huán)境的動(dòng)態(tài)波動(dòng)

圖9 SlHY5、SlCPK27、SlPIF4和BR組成的光信號(hào)調(diào)控通路模擬圖

(圖源：Zhu C,Hu Z,Hu C, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2024)

三、拜譜小結(jié)

研究采用了突變株/突變株雜交驗(yàn)證，酵母雙雜交，原核表達(dá)等實(shí)驗(yàn)方案，RNA-seq、RT-qPCR、WB、ChIP-qPCR、Co-IP等檢測(cè)手段，發(fā)現(xiàn)SlHY5在光信號(hào)傳導(dǎo)中增加SlCPK27的轉(zhuǎn)錄，激活光信號(hào)的傳導(dǎo)，SlCPK27通過(guò)磷酸化SlPIF4使其降解，SlPIF4通過(guò)直接激活SlDWF基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控BR的生物合成，從而抑制了下胚軸的伸長(zhǎng)。拜譜生物作為一家國(guó)內(nèi)領(lǐng)先的多組學(xué)服務(wù)公司，可提供完善成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)、修飾蛋白質(zhì)組學(xué)（如超高深度磷酸化修飾）、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)體系，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘分析，全面解析機(jī)制機(jī)理等，助力高分文章發(fā)表。歡迎咨詢！

參考文獻(xiàn)：

Zhu C, Hu Z, Hu C, Ma H, Zhou J, Xia X, Shi K, Foyer CH, Yu J, Zhou Y. SlCPK27 cross-links SlHY5 and SlPIF4 in brassinosteroid-dependent photo- and thermo-morphogenesis in tomato. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Sep 3;121(36):e2403040121. doi: 10.1073/pnas.2403040121 Epub 2024 Aug 27. PMID: 39190354；PMCID: PMC11388283