大腦的功能是高度多樣化的，包括控制運動、處理感覺信息、學習和記憶形成等。為了完成這些復雜的任務，大腦呈現了一個解剖上不同但連接良好的高度復雜的腦區(qū)亞結構。人們花費了巨大的努力來解開大腦區(qū)域的分子差異，以及繪制它們的連接圖。然而，目前缺乏全面的腦區(qū)蛋白質組學研究。

2023年11月，德國慕尼黑大學Bernhard Kuster團隊在The EMBO journal期刊（IF=11.4）發(fā)表了一篇題為“A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics”的文章。本研究利用高通量人類FFPE腦蛋白質組學技術，通過分析涵蓋 11,000 多種蛋白質的人腦13個區(qū)域共2000+FFPE腦組織樣本，構成了迄今為止最全面的人類大腦蛋白質組圖譜，系統(tǒng)評估并揭示了每個腦區(qū)獨特的蛋白質組學特征。

一 、研究結果

01.FFPE人腦區(qū)域的深度蛋白質組學分析

樣本：

13個腦區(qū)（伏隔核NA、黑質SN、橄欖OB、丘腦THL、紅核NR、海馬體HPC、殼核PUT、鎖核CL、尾狀核CN、小腦CBM+CBw和大腦皮層CC+CCw)。從每個腦區(qū)，收集3個組織塊(~5 × 5 × 5 mm)并獨立處理（OB區(qū)收集2個），共38個樣本，之后蛋白質提取和消化。（圖1）

圖1|人類大腦的區(qū)域分辨蛋白質組圖(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal.,

組織樣本評估：

組織樣本蛋白中位CV在10-20%之間。（圖2）

圖2|樣本評估結果(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2023)

鑒定結果：

①：平均每個組織鑒定到9498個蛋白，所有腦區(qū)域共鑒定到11325個蛋白（圖3E）。

②：比較新鮮冷凍樣品和FFPE樣品，發(fā)現蛋白質表達跨度約為6個數量級。FFPE中檢測到的98.6%蛋白都包含在新鮮冷凍樣本中，但整體強度較低。僅在新鮮冷凍組織中檢測到的大多數蛋白質位于較低的豐度（圖3F-G）。

這項研究通過高通量的蛋白質組學方法，為理解大腦不同區(qū)域的蛋白質表達提供了新的見解，并展示了高效蛋白質鑒定的技術進步。

圖3|不同區(qū)域的腦蛋白分析(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2023

02.腦區(qū)分辨率的人類蛋白質組圖譜分析

區(qū)域蛋白圖譜特征：

13個大腦區(qū)域檢測到共有蛋白占比64%，6%是單個區(qū)域特有的，主要存在于小腦CBM、大腦皮層CC、橄欖OB和海馬體HPC區(qū)。（圖4A）

區(qū)域特征蛋白分析：

根據人類蛋白質圖譜（HPA）原則，定義了四類區(qū)域蛋白富集分類。1類蛋白（593）僅在1個大腦區(qū)域被檢測到，2類（218）與所有其他區(qū)域相比，在1個大腦區(qū)域中至少表達四倍的蛋白質，第3類（77）在2-7個大腦區(qū)域中富集至少四倍），第4類（441）在1個區(qū)域中富集的蛋白質至少是所有其他區(qū)域平均值的四倍）。CBM區(qū)域表達的1、2和4類蛋白占比最高。相比之下，第3類蛋白在各個大腦區(qū)域之間分布更均勻，包括富集在PUT、CN和NAC區(qū)的蛋白質。這三個區(qū)域都是基底神經節(jié)的一部分。（圖4B）

區(qū)域樣本聚類分析：

tSNE分析以及分層聚類證實，解剖學上接近的大腦區(qū)域通常具有相似的蛋白質表達模式。如tSNE圖中，基底神經節(jié)（NAC、CN、PUT）和中腦（NR、SN）區(qū)域的樣本分別聚集在一起。（圖4C）

蛋白組與轉錄組圖譜分析：

有趣的是，在不同組織區(qū)域中，mRNA水平比蛋白質水平更穩(wěn)定。這強調了直接測量蛋白質表達的重要性，特別是在識別某些大腦區(qū)域的標志物時，因為mRNA水平可能沒有改變，但在蛋白水平發(fā)生了明顯變化。（圖4D）

區(qū)域標志物：

1類蛋白質最可能作為區(qū)域標志物，如小腦CBM區(qū)的MDGA1和SLC1A6以及橄欖OB區(qū)中的SBSPON和TPBGL。在大多數大腦區(qū)域中，發(fā)現了許多高豐度的區(qū)域標志物。（圖4E-F）

圖4|腦區(qū)域特異性蛋白表達模式(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 20

腦細胞類型特異性特征：

先前發(fā)表了對主要腦細胞類型（神經元N、小膠質細胞M、星形膠質細胞A和少突膠質細胞O）基于mRNA表達的細胞類型特異性特征，其中許多特征也在本研究的蛋白表達中被檢測到。（圖5A）

神經膠質細胞特征蛋白：

大約85%的基于神經膠質mRNA的特征蛋白在所有腦區(qū)都被檢測到，并且數量相似，例如少突膠質細胞標志物MBP、星形膠質細胞標志物GFAP和小膠質細胞標志物RGS10。其余15%在至少一個大腦區(qū)域中檢測到，包括OB區(qū)的少突膠質細胞蛋白MTUS1以及CBM區(qū)的星形膠質細胞蛋白NFIA和NFIB。（圖5B）

神經元細胞特征蛋白：

同樣，大多數基于神經元mRNA的特征蛋白在所有腦區(qū)域中都檢測到，包括神經元標志蛋白CD200、SYNJ2BP和SPTBN4，其余17%存在區(qū)域富集，包括CC區(qū)的MLIP和OB區(qū)的TPBGL。（圖5C）

圖5|不同細胞類型富集蛋白的蛋白豐度譜(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal.

腦細胞類型特征蛋白的區(qū)域分布：

腦細胞類型特征蛋白的區(qū)域分布：少突膠質細胞（O）的特征蛋白在皮質白質（CCw）區(qū)特別普遍，平均豐度比是其他區(qū)域平均值的1.3倍。白質主要由被少突膠質細胞包裹的神經元軸突組成。相比之下，神經元（N）特征蛋白在皮層（CC）區(qū)最為普遍，而大多數突觸（Synapse）特征蛋白在CC區(qū)豐度較高，其次是HPC和CN。大腦皮層區(qū)前10種最富集的突觸蛋白是SHISA6和SHISA7，以及參與脊柱結構的SYNPO和LRRC7。（圖6）

圖6|不同大腦區(qū)域突觸蛋白的分析(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2

區(qū)域富集蛋白的細胞定位：

非區(qū)域富集的蛋白大多定位于細胞質或膜，而區(qū)域富集的蛋白多定位于細胞核，其次是膜、細胞質、跨膜和分泌。有趣的是，分泌和胞外基質相關蛋白在OB區(qū)高度表達。這些蛋白包括信號線索蛋白SBSPON、ARSF和ANXA2。核定位蛋白主要在小腦區(qū)（CBM）高度表達，包括溴結構域成員和鋅指蛋白家族成員。CBM區(qū)的核蛋白高表達可能是由于小腦灰質中細胞核增大的高密度神經元所致。（圖7）

圖7|區(qū)域富集蛋白的細胞定位分析(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2

藥物靶點的腦區(qū)表達差異：

將FDA批準的藥物靶向的蛋白質列表與蛋白質組學數據相匹配，并確定了470種。其中，68種蛋白在大腦區(qū)域特異性富集。其中包括11個電壓門控離子通道蛋白，以及ITGB3、ANXA2和HDAC2。值得注意的是HDAC2，它在小腦區(qū)顯示出區(qū)域富集，同樣，膜聯(lián)蛋白家族成員ANXA2在皮質白質區(qū)（CCW）富集。此外，被歸類為藥物靶標的3個3類蛋白在特定區(qū)域分布，在基底神經節(jié)區(qū)ACE、DCC和CHAT高度表達，在中腦區(qū)ACE和DDC過度表達。（圖8）

圖8|藥物靶點的腦區(qū)表達差異分析(圖源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2

二、拜譜小結

該研究利用高通量蛋白質組學技術檢測人類FFPE組織樣本，這為分析人類生物樣本庫中數百萬存檔組織樣本提供了巨大潛力；同時對13個腦區(qū)的分析揭示了獨特的蛋白質組特征，識別了一些已知的特定腦區(qū)標志物和許多新候選物，發(fā)現mRNA與蛋白質水平存在顯著差異，強調了直接測量蛋白水平的重要性。

對于FFPE樣本及其不同區(qū)域的蛋白質組分析，拜譜生物對切片脫蠟、蛋白提取、肽段酶解、上機測試等全流程進行優(yōu)化，并結合全新一代Astral質譜平臺高穩(wěn)定性、高靈敏度、高通量、高深度的優(yōu)勢，開啟“超高深度FFPE蛋白質組”鑒定新紀元。拜譜生物已研發(fā)完成并建立了完善成熟的轉錄組學、蛋白組學、代謝組學以及多組學聯(lián)合產品技術服務體系，助力發(fā)表高分文獻，歡迎致電咨詢！

參考文獻：Tüshaus J, Sakhteman A, Lechner S, The M, Mucha E, Krisp C, Schlegel J, Delbridge C, Kuster B. A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics. EMBO J. 2023 Dec 1;42(23):e114665. doi: 10.15252/embj.2023114665.