牛肉是世界上消費(fèi)最廣泛的肉類(lèi)之一，牛肉質(zhì)量決定消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)決策。屠宰后肌肉組織細(xì)胞開(kāi)始經(jīng)歷多種形式的死亡，如壞死、凋亡、焦亡和自噬，這是肌肉轉(zhuǎn)化為肉的第一步，這一過(guò)程引發(fā)了一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)。鐵死亡是最近在冷藏牛肉中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡過(guò)程，其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞死亡可能會(huì)降低肌肉質(zhì)量，但其機(jī)制尚不清楚。

2023年9月26日，寧夏大學(xué)劉敦華教授團(tuán)隊(duì)在Food Chemistry（IF=8.8）上發(fā)表題為“TMT quantitative proteomics analysis reveals molecular mechanism of ferroptosis during beef refrigeration”的研究文章。研究人員利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)共鑒定出377個(gè)差異表達(dá)蛋白(DEPs)。轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX) 4和血紅素加氧酶1等15種DEPs參與脂質(zhì)過(guò)氧化、Fe2+ 和Fe3+ 轉(zhuǎn)化、鐵離子積累和線粒體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)鐵死亡。此外，化學(xué)致癌物ROS、谷胱甘肽代謝、HIF-1和PPAR等信號(hào)通路可能通過(guò)影響游離鐵過(guò)載和GPX4失活來(lái)促進(jìn)鐵凋亡。該研究成果中 拜譜生物 為其提供 TMT蛋白組學(xué) 的檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)的差異蛋白有助于拓展屠宰后牛肉儲(chǔ)存過(guò)程中鐵死亡的生理和分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

文章名稱(chēng)：TMT quantitative proteomics analysis reveals molecular mechanism of ferroptosis during beef refrigeration（FOOD CHEM.，IF=8.8，2023.09）

客戶單位：寧夏大學(xué)

研究材料：牛肉

分組信息：不同冷藏時(shí)間的成品肌肉組織

拜譜提供技術(shù)：TMT蛋白質(zhì)組學(xué)

PART 01

研究結(jié)果

研究人員探究隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)牛肉的硬度、持水力、色澤、游離鐵含量、ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化物、MDA、GSH和GPX4水平來(lái)評(píng)估肌肉組織細(xì)胞的鐵死亡狀態(tài)。結(jié)果顯示，冷藏時(shí)間延長(zhǎng)后，牛肉的硬度在第4天和第6天顯著下降；持水能力降低；顏色變深，失去光澤，鮮紅色變?yōu)榘导t色。此外，游離鐵、活性氧和MDA的含量顯著增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。

研究人員提取不同冷藏時(shí)間的肌肉樣品的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析，蛋白質(zhì)條帶在不同時(shí)期分布均勻且相似（圖1a）。根據(jù)蛋白在不同樣品中的表達(dá)情況，分析發(fā)現(xiàn)同一組樣品的中位數(shù)接近于同一水平（圖1b），說(shuō)明肌肉樣品蛋白質(zhì)具有良好的組內(nèi)相似性和組間差異性。

蛋白質(zhì)組學(xué)共鑒定出1996種蛋白質(zhì)。以B0為對(duì)照組，篩選B1、B2、B4和B6中的蛋白進(jìn)行差異表達(dá)分析，共鑒定到377個(gè)DEPs。將火山圖可視化，并根據(jù)FC > 1.2、FC < 0.86和P < 0.05兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分析DEP。結(jié)果如圖1c-f所示，在B1/B0、B2/B0、B4/ B0和B6/B0中分別鑒定出22、33、73和140個(gè)DEPs，其中分別上調(diào)6、11、32和88個(gè)，下調(diào)16、22、41和52個(gè)。聚類(lèi)方法評(píng)估了不同冷藏階段肌肉組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯示肌肉蛋白表達(dá)差異隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加而增加（圖1g）。

圖1| 不同冷藏時(shí)間的肌肉樣品蛋白質(zhì)組學(xué)(圖源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 2023)

隨后研究人員對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，GO術(shù)語(yǔ)分為生物過(guò)程（BP）、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)。如圖2所示，BP組的DEPs主要參與細(xì)胞過(guò)程(148)、代謝過(guò)程(116)、生物調(diào)節(jié)(78)、生物過(guò)程調(diào)節(jié)(74)和對(duì)刺激的反應(yīng)(57)。MF組的DEPs主要參與結(jié)合(114)、催化活性(75)等。CC組的DEPs主要涉及細(xì)胞解剖實(shí)體(171)和含蛋白復(fù)合物(56)等。為了在分子水平上闡明DEPs在細(xì)胞和生物體中的功能和通路，研究人員將DEPs富集的KEGG通路進(jìn)行注釋和鑒定。圖2b顯示了前20個(gè)富集通路，包括鐵死亡、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、神經(jīng)變性-多發(fā)性疾病通路、碳代謝、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))和氧化磷酸化。其中，參與鐵死亡途徑的DEPs有15個(gè)。

為了進(jìn)一步探索與鐵死亡相關(guān)的通路相互作用，對(duì)鑒定的15個(gè)DEPs進(jìn)行了KEGG通路分析。參與鐵死亡的前20條相關(guān)途徑（圖2c）主要包括細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、代謝和機(jī)體系統(tǒng)。鐵死亡是細(xì)胞衰老和壞死的重要過(guò)程。其中38個(gè)差異表達(dá)的蛋白參與了總共38條途徑（圖2d）。蛋白相互作用分析表明，除VDAC3和PRNP外，所有蛋白相互作用調(diào)節(jié)鐵死亡（圖2e）。對(duì)已鑒定的與鐵下垂有關(guān)的DEPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)與鐵死亡有關(guān)的代謝過(guò)程主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、膜、高爾基體和細(xì)胞外區(qū)（圖2f和g）。

圖2| 不同冷藏時(shí)間的肌肉樣品差異蛋白分析(圖源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 2023)

研究人員根據(jù)TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果，選擇15個(gè)參與鐵死亡調(diào)控的蛋白進(jìn)行PRM定量驗(yàn)證。如表1所示，每個(gè)蛋白至少含有1個(gè)唯一性肽段，由于蛋白的同一性和豐度要求，通過(guò)PRM用目標(biāo)肽片段的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與TMT定量蛋白測(cè)定相同，參與鐵死亡途徑的15種蛋白的離子豐度變化趨勢(shì)相同，有8種DEPs上調(diào)，7種DEPs下調(diào)。

表1 鐵死亡蛋白肽的PRM定量分析(表源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 2023)

總的來(lái)說(shuō)，鐵蛋白水平的下調(diào)（圖3）表明它在制冷過(guò)程中被降解了。HMOX1的上調(diào)表明在冷藏過(guò)程中發(fā)生了血紅素降解。PCBP2水平的降低抑制了FPN介導(dǎo)的 Fe2+易位過(guò)程。此外，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外腔室的 Fe2+在銅藍(lán)藻的作用下迅速轉(zhuǎn)化為 Fe3+，與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的 Fe3+通過(guò)TBITFR1復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)腔室，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PCBP1/2水平的降低。PCBP1和PCBP2蛋白表達(dá)水平降低，表明與 Fe2+大分子的結(jié)合過(guò)程減弱，這也促進(jìn)了 Fe2 +在細(xì)胞內(nèi)的積累。GSH水平下調(diào)表明GPX4功能下降，可能導(dǎo)致鐵死亡過(guò)程增強(qiáng)，同時(shí)ROS水平顯著升高，ROS水平升高提示肌肉組織抗氧化能力下降，肌肉組織氧化增強(qiáng)。CSL4和LPCAT3蛋白水平升高，表明AA途徑被激活，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛水平升高。脂質(zhì)是肌肉的重要組成部分，也是肌肉系統(tǒng)中化學(xué)性質(zhì)最不穩(wěn)定的成分之一，鐵死亡途徑通過(guò)細(xì)胞膜氧化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖3| 基于KEGG富集差異表達(dá)蛋白的鐵死亡機(jī)制(圖源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 202

PART 02、拜譜小結(jié)

作者利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)15個(gè)參與鐵死亡調(diào)節(jié)的DEPs，包含鐵離子運(yùn)輸、 Fe2+ 和 Fe3+轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)氧化途徑、氧化還原調(diào)節(jié)和含鐵蛋白降解途徑。鐵死亡依賴(lài)于鐵離子積累、GPX4失活和脂質(zhì)過(guò)氧化。此外，通過(guò)對(duì)DEPs的蛋白質(zhì)和途徑相互作用分析，發(fā)現(xiàn)了37條代謝途徑，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵超載、細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜脂質(zhì)氧化和ROS積累來(lái)促進(jìn)鐵死亡。鐵下垂機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可能為提高牛肉冷藏品質(zhì)的相關(guān)研究提供新的視角，可能有助于預(yù)測(cè)肉類(lèi)的潛在質(zhì)量和鑒定鐵下垂的生物標(biāo)志物。這一過(guò)程中拜譜生物提供了TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)，拜譜生物已研發(fā)完成并建立了完善成熟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及多組學(xué)聯(lián)合產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)體系，歡迎致電咨詢(xún)！

參考文獻(xiàn)：Liu J, Liu D, Hu Z, Hu Y, Yu X. TMT quantitative proteomics analysis reveals molecular mechanism of ferroptosis during beef refrigeration. Food Chem. 2023 Sep 26. doi: 10.1016/j.foodchem.2023.137596.